摘要：[目的]构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,转染A549肿瘤细胞,观察E-cadherin的表达。[方法]根据Gene Bank E-cadherin的序列,选择设计两条序列和一条无关RNAi序列作为对照,通过Mlu I和Nde I两个酶切位点,将设计好的siRNA片段插入包装质粒PHR-SIN-CSGW-H1a(PHR)构建E-Cadherin RNAi慢病毒载体PHR-EA、PHR-EB。PCR扩增E-cadherin基因与pc DNA3.1质粒使用Bam HI、Xho I双酶切,连接鉴定后,亚克隆至慢病毒载体PHR,构建-E-cadherin过表达慢病毒载体PHR-E-cadherin。慢病毒包装后,感染A549肿瘤细胞,观察表达。[结果]成功构建E-cadherin过表达和RNAi慢病毒载体,并分别经PCR和质粒酶切鉴定。RTPCR检测E-cadherin的干扰和过表达情况,两个E-cadherin的RNAi病毒感染细胞后,都能使目的基因表达下调,而E-cadherin过表达慢病毒转染后细胞的E-cadherin表达明显提高了。Western Blot检测证实E-cadherin的表达确实被慢病毒所上调和干扰。[结论]成功构建出E-cadherin基因过表达和RNAi慢病毒载体,并在A549肿瘤细胞中成功表达,为进一步转染神经干细胞观察其生物学影响及对脊髓损伤修复的效果奠定基础。

摘要：背景:趋化素在动脉粥样硬化时的表达水平上调,趋化素及其受体CMKLR1可能参与了动脉粥样硬化的病理过程。目的:建立CMKLR1基因缺陷性小鼠血管平滑肌细胞株。方法:以小鼠CMKLR1基因mR NA序列作为干扰靶点,设计3组靶向CMKLR1基因的shR NA序列,构建慢病毒载体,筛选出干扰最佳的shR NA,在293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养小鼠血管平滑肌细胞,转染慢病毒形成CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞株,用real-time PCR检测感染慢病毒后细胞中CMKLR1 mR NA水平。结果与结论:基因测序结果表明慢病毒载体构建成功,慢病毒的滴度约为8.7×106 TU/m L,p LVX-sh RNA3对CMKLR1基因的抑制效果最显著(P<0.001)。将p LVX-shR NA3转染至血管平滑肌细胞中形成基因缺陷细胞株,用real time PCR血管平滑肌细胞中CMKLR1 mR NA水平,该细胞株中CMKLR1 mR NA水平显著下降(P<0.001),表明慢病毒介导的si RNA可有效沉默小鼠血管平滑肌细胞中CMKLR1基因的表达。

摘要：背景:研究发现促红细胞生成素尚具有多种非血液系统生理效应,如参与哺乳动物胚胎的正常发育、抑制炎症、促进血管生长,以及在多种组织和细胞损伤中抑制细胞凋亡、减少梗死面积、促进功能恢复等作用。目的:观察重组人促红细胞生成素与骨骼肌卫星细胞联合移植对兔急性心肌梗死是否具有积极作用?设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-01/07在深圳市人民医院中心实验室完成。材料:自体移植:清洁级雄性新西兰大白兔50只,随机分为假手术组、模型对照组、细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组,10只/组。异体异性移植:同品系雄性新西兰大白兔10只,作为供体用于制备骨骼肌卫星细胞;另取雌性兔10只作为受体,分为细胞移植组、联合组,5只/组。重组人促红细胞生成素为沈阳三生制药股份有限公司产品。方法:自体移植实验:除假手术组外,其余4组建立急性心肌梗死模型。重组人促红细胞生成素组、联合组在冠脉结扎同时,采用肌注法一次性给予重组人促红细胞生成素3000U/kg;细胞移植组、联合组将含有约107个骨骼肌卫星细胞的DMEM溶液200μL多点直接注射在心脏表面梗死区。异体异性移植实验:细胞移植组、联合组均建立急性心肌梗死模型,根据分组要求注射骨骼肌卫星细胞和重组人促红细胞生成素,浓度及方法同上,5d后取材行PCR检测。主要观察指标:测定心肌梗死面积,免疫组织化学法检测心肌组织血运改善及desmin表达,荧光检测骨骼肌卫星细胞,SRY基因PCR检测结果。结果:移植后4周与模型对照组比较,细胞移植组、重组人促红细胞生成素组、联合组心肌梗死面积均明显减小(P<0.05),且联合组减小幅度强于另外两组(P<0.05)。各组梗死中心区CD34阳性细胞数量与上面结果相似。细胞移植组、联合组心肌组织desmin呈阳性表达,其余3组呈阴性。联合组移植区DAPI标记的蓝色荧光细胞数较细胞移植组明显增多。异体异性移植实验中,联合组SRY基因扩增条带的宽度和亮度均明显强于细胞移植组。结论:重组人促红细胞生成素与骨骼肌卫星细胞联合移植能够进一步缩小兔心肌梗死面积,改善梗死区血运,提高骨骼肌卫星细胞移植后的存活率,二者对治疗急性心肌梗死具有协同作用。

摘要：背景：血管平滑肌细胞过度增殖是血管支架置入或血管成形后发生再狭窄的重要机制,如能有效调控血管平滑肌细胞增殖必将对再狭窄的治疗产生积极影响。目的：观察PTEN基因对血管损伤后再狭窄的调控作用和过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂罗格列酮对血管平滑肌细胞PTEN蛋白表达的作用。设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-01/03在深圳市人民医院动物实验中心完成。材料：SPF级雄性SD大鼠45只,体质量350～400g,用于建立大鼠颈动脉球囊损伤模型。方法：45只SD大鼠随机数字表法分为对照组,损伤组和罗格列酮组,每组15只。损伤组：球囊损伤左侧颈总动脉,在球囊损伤前3d开始给予生理盐水灌胃;罗格列酮组：在左侧颈动脉球囊损伤前3d开始给予过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂罗格列酮5mg/（kg？d）灌胃;对照组为手术找出左侧颈总动脉,但不予球囊损伤,术前3d开始给予生理盐水灌胃。3组分别于球囊损伤后14d取材。主要观察指标：病理切片观察大鼠颈总动脉形态学变化,免疫组织化学检测各组血管PTEN、α-actin的表达,WesternBlot检测各组PTEN表达量的改变。结果：①球囊损伤后14d各组标本苏木精-伊红染色可见不同程度内膜增厚。病理切片结果分析显示,损伤组内膜增生程度明显高于对照组（P〈0.05）,罗格列酮组内膜增生程度明显低于损伤组（P〈0.05）。②PTEN主要表达在血管平滑肌细胞胞浆,胞核亦有部分表达。③WesternBlot检测各组目的条带与内参α-actin的灰度值比值发现,罗格列酮组PTEN表达量较其他两组明显增高（罗格列酮组0.82±0.06,损伤组0.54±0.05,对照组0.57±0.03,P〈0.05）。结论：PTEN基因在调控血管损伤后再狭窄中起重要作用,促进血管平滑肌细胞PTEN表达可能是过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂罗格列酮治疗血管损伤后再狭窄机制之一。

摘要：目的通过慢病毒介导的RNA干扰技术,构建趋化素基因Chn1的小分子干扰RNA慢病毒表达载体,建立Chn1基因缺陷性小鼠血管平滑肌细胞株,为下一步采用该细胞株研究趋化素与冠状动脉介入治疗后再狭窄的关系奠定实验基础。方法以小鼠Chn1基因mRNA序列作为干扰靶点,设计3组靶向Chn1的shRNA序列,构建慢病毒载体,并筛选出干扰最佳的shRNA,在293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养小鼠血管平滑肌细胞,转染慢病毒形成Chn1基因缺陷性血管平滑肌细胞株,用实时定量荧光(real time)PCR检测感染慢病毒后细胞中Chn1 mRNA水平。结果基因测序结果表明慢病毒载体构建成功,慢病毒的滴度约为7.4×106TU/m L。3个p LVX-shRNA均能下调Chn1 mRNA,其中p LVX-shRNA3的沉默效果最明显(P<0.01)。将干扰效果最佳的慢病毒载体p LVX-shRNA3包装慢病毒并转染至血管平滑肌细胞中形成基因缺陷细胞株,用real time PCR血管平滑肌细胞中Chn1 mRNA水平,该细胞株中Chn1 mRNA水平显著下降(P<0.01)。结论慢病毒介导的siRNA可有效沉默血管平滑肌细胞中Chn1基因的表达。

摘要：背景：骨骼肌卫星细胞心肌移植过程中，一些重要环节仍无法很好的解决，其中就包括骨骼肌卫星细胞移植后的死亡问题。促红细胞生成素从生产到临床使用技术都很成熟，具有抗凋亡和减轻炎症反应的作用。目的：探讨促红细胞生成素对鼠骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响，从而为二者联合进行心肌移植的设想提供一些支持依据。设计、时间及地点：细胞生物学行为体外实验，于2006—07／2007-10在暨南大学医学院中心实验室和深圳市人民医院中心实验室完成。材料：清洁级1～3d龄SD乳鼠6只，促红细胞生成素为沈阳三生制药公司产品。方法：改良酶消化法分离培养鼠骨骼肌卫星细胞，传至第3代分别加入含0，10，20，40u／mL促红细胞生成素的DMEM培养基。主要观察指标：倒置显微镜下观察骨骼肌卫星细胞分化能力，MTT法检测细胞活力，流式细胞仪分析细胞周期。结果：未加入促红细胞生成素组培养5d，局部相邻的骨骼肌卫星细胞可以互相融合成长条状的肌管，随时间延长肌管数量逐渐增多，且能看见肌管跳动；10，20，40u／mL促红细胞生成素组均未见肌管形成，骨骼肌卫星细胞大量堆积在一起。与未加入促红细胞生成素组比较，作用48h，72h时各浓度促红细胞生成素组骨骼肌卫星细胞活力均明显升高（P〈0．05）。随促红细胞生成素浓度的升高，G。期细胞所占百分率逐渐降低，而S＋G2/M期细胞所占百分率逐渐升高。结论：促红细胞生成素呈剂量依赖性提高骨骼肌卫星细胞活力、促进骨骼肌卫星细胞增殖，并抑制其向肌管分化。

摘要：对十五层钢筋混凝土框架结构工程实例,利用SAP2000程序进行非线性动力时程分析,利用OPENSEES进行模态Pushover分析,对比分析表明,考虑结构模态数越多,则模态Pushover分析结果越来越接近时程分析平均值。采用简化模态Pushover分析过程的方法,可以较好地应用于高层钢筋混凝土结构的分析。