摘要：目的制备抗甲型流感病毒短发夹状RNA分子(short hairpin RNA,shRNA),并鉴定其功能。方法针对甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)核壳蛋白(nucleoprotein,NP)和酸性RNA多聚酶(acidic RNA polymerase,PA)编码mRNA高度保守区序列设计并制备编码shRNA的双链DNA转录模板,分别将其插入pGenSil-1质粒,构建NP-shRNA和PA-shRNA表达载体,测序正确后,采以T7转录试剂盒制备NP-shRNA和PA-shRNA。将所制备的2种shRNAs分别或联合转入人气道上皮细胞(human bronchial epithelium,HBE),然后感染IAV A/PR8株,通过测定HBE细胞病变效应(cyto-pathogenic effect,CPE)、培养上清液病毒滴度以及NP、PA mRNA与蛋白表达水平,评估所制备的shRNAs对IAV A/PR8在HBE细胞中复制的抑制效果。结果编码shRNA的2种双链DNA转录模板序列正确。通过体外转录技术制备的NP-shRNA、PA-shRNA每100μl含量分别为59.4、50.6nmol,纯度均在2.0以上,浓度和纯度均高。与未转染shRNA的对照组比较,NP-shRNA、PA-shRNA、NP-shRNA+PA-shRNA转染组细胞内NP mRNA分别减少41.7%、44.1%和68.5%,PAmRNA分别减少43.4%、60.9%和73.7%,NP蛋白表达分别降低92.3%、84.0%和91.7%,CPE显著减轻,培养上清液病毒滴度显著下降。结论成功构建了2种抗IAV短发夹RNA分子,所制备的NP-shRNA、PA-shRNA对IAV A/PR8株在HBE细胞中复制有显著的抑制效果。

摘要：目的构建和鉴定铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb)-OprF疫苗。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株提取总RNA为模板,自行设计引物,RT-PCR扩增获得OprF抗原编码基因,经酶切、连接定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF。转化***21(DE3)感受态细胞,抽提质粒行酶切电泳和测序验证后,电穿孔转化到Bb中,构建铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果 RT-PCR扩增出1 016bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切鉴定,切出4 947bp的载体片段和10 16bp的目的基因片段;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1 016bp的oprF基因片段。结论成功构建了铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定基础。

摘要：目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株总RNA为模板,自行设计引物,采用RT-PCR方法扩增OprF抗原编码基因,经酶切、连接后定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF,转化***21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1 016 bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切和测序鉴定证实OprF基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析表达产物分子质量单位约为61 ku,与预期结果一致,表达的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别。结论成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,该质粒在***21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。

摘要：目的:比较异丙托溴铵气雾剂、噻托溴铵干粉剂治疗轻、中度稳定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者6周、12周的小气道肺功能参数变化。方法:采用随机、单盲、平行对照试验设计,入选42例COPD稳定期患者,分为噻托溴铵干粉剂吸入组(18μg/次,每天1次),异丙托溴铵气雾剂吸入组(40μg/次,qid),总疗程12周。结果:治疗6周末,2组间肺功能无统计学差异,同基线值比较异丙托溴铵组仅最大用力呼气中期流速(FEF25-75)有增高;治疗12周末,噻托溴铵组较异丙托溴铵组FEVl、FEF25、FEF50、FEF25-75均有明显改善,同基线值比较,亦有显著性增加;并且噻托溴铵组用药12周末较6周末患者FEF25增加有显著性意义(P<0.05)。结论:噻托溴铵较异丙托溴铵更能改善轻、中度稳定期COPD患者的肺功能,包括小气道肺功能。

摘要：目的评价化疗加免疫长疗程方案治疗耐多药肺结核的疗效和安全性。方法对203例耐多药肺结核患者，采用1：1随机、平行对照的方法，分为治疗组和对照组，两组患者除采用对氨基水杨酸异烟肼、利福喷丁、左旋氧氟沙星、丙硫异烟胺、克拉霉素和阿米卡星治疗外．治疗组患者加用免疫调节剂母牛分枝杆菌菌苗（***，微卡），对照组患者不加用母牛分枝杆菌菌苗，疗程共18个月。结果治疗结束时（18个月）治疗组和对照组痰抗酸菌涂片阴性同时痰结核分枝杆菌培养阴性（涂阴培阴）分别为74．5％（73／98）和72．5％（66／91），（X^2=0．09，P=0．7599）。两组比较差异无统计学意义。X线影像结果表明，两组的病灶显效率分别为72．5％（71／98）和47．3％（43／91），差异有统计学意义（F=12．52，P=0．0004，P〉0．05）;有效率分别为90．8％（89／98）和82．4％（75／91），差异无统计学意义（X2=2．90，P=0．0886，P〉0．05）;空洞闭合率分别为33．3％（27／81）和22．1％（17／77），差异无统计学意义（秩和检验F=1．52，P=0．1294，P〉0．05）。免疫学指标CD8在治疗6月时治疗组高于对照组，CD3治疗后与治疗前免疫指标差值在3个月和9个有统计学差异外，其余CD4，CD4／CD8，NK细胞，IL-2R各治疗阶段，治疗组与对照组近似，无统计学差异。临床症状咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困难、乏力等症状有改善，治疗组改善程度均大于对照组。结论本研究所设计的方案对耐多药肺结核病均有明确的疗效，具有有效的杀菌、抑菌作用，加用免疫调节剂在促进病灶吸收、症状改善方面有一定的作用。

摘要：目的评价化疗加免疫长疗程方案治疗耐多药肺结核的疗效和安全性。方法对203例耐多药肺结核患者,采用1∶1随机、平行对照的方法,分为治疗组和对照组,2组患者除采用对氨基水杨酸异烟肼、利福喷汀、左旋氧氟沙星、丙硫异烟胺(Pt)、克拉霉素和阿米卡星治疗外,治疗组患者加用免疫调节剂母牛分枝杆菌菌苗(***,微卡),对照组患者不加用母牛分枝杆菌菌苗,疗程共18个月。结果治疗结束时(18个月)治疗组和对照组痰抗酸菌涂片阴性同时痰结核分枝杆菌培养阴性(涂阴培阴)分别为74.5%(73/98)和72.5%(66/91),(χ2=0.09,P=0.7599)。2组比较差异无统计学意义。X线影像结果表明,2组的病灶显效率分别为72.4%(71/98)和47.3%(43/91),差异有统计学意义(χ2=12.52,P=0.0004,P>0.05);有效率分别为90.8%(89/98)和82.4%(75/91),差异无统计学意义(χ2=2.90,P=0.088 6,P>0.05);空洞闭合率分别为33.3%(27/81)和22.1%(17/77),差异无统计学意义(秩和检验F=1.52,P=0.1294,P>0.05)。免疫学指标CD8阳性原细胞在治疗6个月时治疗组高于对照组,CD3阳性原细胞治疗后与治疗前免疫指标差值在3和9个月差异有统计学意义外,其余CD4,CD4/CD8,NK细胞,IL-2R等免疫学指标在各治疗阶段,治疗组与对照组近似,差异无统计学意义。临床症状咳嗽、咳痰、胸痛,呼吸困难,乏力等症状有改善;治疗组改善程度均大于对照组。结论本研究所设计的方案对耐多药肺结核病均有明确的疗效,具有有效的杀菌、抑菌作用,加用免疫调节剂在促进病灶吸收,症状改善方面有一定的作用。