摘要：目的 :利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体。方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体。应用SDS-PAGE、Western blot、ELISA、免疫共沉淀、亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性。结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg。结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用。

摘要：目的 :利用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统对狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein,RVG)基因进行克隆、表达、纯化,并对重组RVG进行免疫学特性鉴定。方法:参照Gen Bank收录的狂犬病病毒CVS-11株RVG基因序列,设计特异性引物,扩增目的基因。RVG基因经Bam HⅠ/KpnⅠ双酶切后定向克隆到p Fast Bac-GP67B载体上,阳性重组转座质粒进一步转化*** DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后获得重组穿梭载体r Bacmid-RVG,将其转染至对数生长期的Sf-9昆虫细胞,进行重组RVG的真核表达。His-Trap HP纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。重组RVG免疫小鼠,检测其免疫原性和血清中和活性。结果:用Bac-To-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统表达并纯化了重组RVG,分子量约58 000。经重组RVG免疫后的小鼠血清具有中和活性。结论:重组RVG具有天然RVG的活性,为进一步研制亚单位疫苗及制备筛选中和抗体奠定了基础。