摘要：建立寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)和黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)3种蚊媒传染病核酸快速实时荧光定量检测方法。以寨卡病毒polyprotein gene基因,登革病毒NS5基因,黄热病毒3’UTR基因作为靶区域设计相应的引物探针,探针的5’端分别标记不同的荧光基团,3’端标记相应的淬灭基团,对扩增体系中引物探针浓度、热启动Taq酶浓度、逆转录酶浓度、RNA酶抑制剂浓度分别进行优化。构建了一种可同时用于寨卡病毒、登革病毒和黄热病毒三重快速荧光PCR检测体系,25μL扩增体系中ZIKV、DENV和YFV的引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和240 nmol/L;探针浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和80 nmol/L;热启动Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的终浓度为分别为2.5U/反应、60U/反应和80U/反应。该检测体系对3种病原体的最低检测限均为1.0×10^(3)拷贝/mL,在MIC IAT C2-48和ABI7500两种不同型号的实时荧光定量PCR仪上检测结果一致,对登革热、寨卡和黄热病毒血清样本检测均为阳性扩增,与丙型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、副流感病毒、腺病毒等无交叉反应。因此,本研究建立的寨卡病毒、登革病毒和黄热病毒的三重快速荧光PCR检测体系可用于对上述3种病毒的定性或定量检测。

摘要：早期快速诊断是防控呼吸道病毒传播的有效手段,研发灵敏、特异、快速的分子检测技术方法是早期防控的前提和保障。本研究建立同时快速检测甲型流感病毒(InfluenzaAvirus,FluA)、副流感病毒1型(Human parainfluenza virus 1,HPIV-1)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)通用型、人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)、人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)通用型和腺病毒B型(Adenovirus type B,AdVB)6种呼吸道病毒重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)检测体系新的技术方法。选择人β-actin基因外显子区域序列作为内标基因,根据6种病毒特异性基因的保守区设计引物探针,结合商业化的逆转录重组酶聚合酶扩增(Revers transcript recombinases polymerase amplification,RT-RPA)反应试剂,优化体系的引物及探针浓度、温度、反应时间,构建6种病毒的RT-RPA检测体系。优化后病毒和内标基因的RT-RPA检测引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和200 nmol/L,最佳反应温度为39℃,最优反应时间为15 min。敏感性实验结果表明,本研究建立的RT-RPA反应体系对6种病毒的敏感性为1.0×104拷贝/mL,其中,对AdV-B的敏感性高达1.0×103拷贝/mL;特异性试验结果表明,不同病毒间特异性好,无交叉反应;重复性试验结果表明,6种病毒对高浓度(1.0×107拷贝/mL)和低浓度(1.0×104拷贝/mL)标准品检测出峰时间T变异系数小于5%,重复性好;对100例临床标本进行回顾性实验测试,与市售实时荧光PCR检测试剂盒的阳性符合率、阴性符合率和总体符合率均为100%。本研究提示,建立的RT-RPA检测体系可用于国境口岸对上述6种呼吸道病毒的日常监测与快速检测。

摘要：建立了一种适合于国境口岸简便、快速、灵敏和特异检测人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)的核酸检测方法。通过建立基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术,针对HCoV-NL63核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)基因序列设计出6条特异性引物,在等温条件下(63℃)进行扩增反应60min,在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,并结合浊度仪进行实时监测,以最终反应颜色变化作为结果判断标准。利用该方法对同种属其他人冠状病毒、诺如病毒、流感病毒进行检测,以分析该方法的诊断特异性。应用该方法对梯度稀释的HCoV-NL63病毒RNA进行检测,以分析该方法的诊断灵敏性,并与常规real-time RT-PCR方法进行比较。结果显示,本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法在短时间内(40min)即可达到对HCoV-NL63的快速检测。该检测方法与加入其它病毒RNA模板溶液颜色均不产生改变,具有较高的检测特异性。检测灵敏性最低检测下限为1 600拷贝/反应。本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-NL63冠状病毒现场快速检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力。

摘要：目的：对来自北京儿童医院的两份人冠状病毒NL63（human coronavirus NL63， HCoV-NL63）阳性样本进行病毒全基因组序列测定和分析。方法以荷兰株（NL63_Amsterdam 1）为参考株，设计18对包含重叠区域的、覆盖全长基因组的引物，采用病毒RNA提取、RT-PCR分段克隆测序的方法获得NL63国内株全长基因组序列；通过与其他毒株的比对分析，构建其系统发生树。结果NL63国内株基因组全长27538 bp，与参考株核苷酸相似性为99．1％，其中在1a区有连续15个碱基的缺失。系统发生分析表明，NL63目前可分为A型、B型、C型和D型共4个基因型，而国内株处在新的基因型（ D型）。结论本研究首次获得了两株NL63国内分离株的全基因组序列，进一步阐明了基因组的结构特征，对其遗传进化作了系统分析，为国内NL63病毒的分子流行病学研究提供参考。

摘要：微流控芯片是可以把待分析样品的前处理、反应、分离、检测和收集等基本操作集成到一体的微全分析系统。微芯片因其在微尺度下进行反应的各项过程,具有消耗样品量少,耗费时间短、效率高、成本低等优势,引起了研究者的广泛关注。本文设计了基于酶促免疫反应的微流控芯片,开发了集成化、小型化的快速检测设备,进行快速提取、反应,以神经氨酸酶作为检测靶标,可用于相关呼吸道传染病的快速检测,该设备具有设备轻巧、高度稳定、高度灵敏和特异性高等优点。

摘要：目的建立2012年确定的新冠状病毒的分子检测方法，并筛选优化引物与探针。方法依据最先发表的208bp长的新冠状病毒1b片段核酸序列，比对分析后设计合成常规RT—PCR引物1对及荧光定量RT—PCR引物1对与TaqMan探针2条（TZl，TZ2），同时合成锁核酸修饰的TaqMan探针2条（LNA-TZl，LNA-TZ2）。建立检测新冠状病毒感染的常规RT—PCR方法与4种荧光定量RT—PCR，分析比较其灵敏度与特异性，同时参照欧洲发表的2种荧光定量RT—PCR引物与探针对（upE，ORFlb）建立相应方法，以合成的阳性模板比较6对荧光定量RT—PCR引物与探针的检出灵敏度。结果所合成的常规RT—PCR与荧光定量RT—PCR引物与探针皆有较好特异性，不能扩增其他人冠状病毒模板及常见呼吸道病毒模板，检出下限达50～500拷贝／反应。锁核酸修饰TaqMan探针可改善荧光定量PCR检测方法的反应性能，经锁核酸修饰的TaqMan探针与常规TaqMan探针相比，检出率提高10倍左右，其中LNA—TZl与upE探针对具最佳反应性能。结论本研究所建立的常规RT—PCR与荧光定量RT—PCR可用于新冠状病毒的分子检测，并推荐使用LNA—TZl与upE探针对。本研究为新冠状病毒分子检测方法应用与改进奠定了基础。

摘要：近来,一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的COVID-19突发疫情,给全球公众健康和社会经济构成严重威胁。SARS-CoV-2成为继人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E,HCoV-229E)、人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63,HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(Human coronavirus HKU1,HCoV-HKU1)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)后第七种感染人类的冠状病毒。本研究以高分辨毛细管电泳技术为基础,针对七种人冠状病毒基因保守区分别设计特异性引物对,经常规PCR扩增后,通过具备单碱基差异分辨率的毛细管电泳分析,实现快速检测七种人冠状病毒的目标。通过构建基于毛细管电泳的人冠状病毒分子靶标,实现同时快速精准鉴定七种人冠状病毒的目的。本研究建立的人冠状病毒毛细管电泳快速检测技术方法具有极高灵敏性和精确性,分辨率高而且特异性好,操作简便成本低廉,为人冠状病毒的临床诊断、口岸快速检测等提供了新的技术支持。

摘要：目的 建立基于颜色判定的适用于国境口岸简便、快速、灵敏和特异的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法检测人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)核酸。方法 通过序列比对,选择HCoV-OC43(Gen Bank号:KU131570)为参考株,根据其核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白基因保守区序列设计6条特异性引物,在65℃等温条件下扩增45min。在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,以最终反应颜色变化作为结果判断标准。对病毒核酸依次倍比稀释以检验该方法的灵敏性;同时,对甲型、乙型流感病毒和其他HCoV进行检测,以检验该方法的特异性。结果 通过引物筛选最终选定了1组特异性引物,仅能与HCoV-OC43病毒核酸产生特异性反应并出现颜色改变,而与其他病毒均不能产生颜色变化,具有较高的特异性。与常规荧光定量RT-PCR法相比,该方法检测灵敏度达5.6拷贝/反应,灵敏度更高,且在短时间内达到对HCoV-OC43基因快速检测的目的。结论 建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-OC43病毒快速、灵敏、特异性检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力。