摘要：目的:探讨肝癌Hep3B细胞白细胞抗原-G(HLA-G)过表达对NK细胞体外杀伤作用的影响。方法:实验分为正常对照组(无干预措施,Hep3B组)、空载体对照组(转染空质粒,Hep3B-GFP组)和实验组(转染pEGFP-C1-HLA-G质粒,Hep3B-HLA-G组)。构建HLA-G真核表达质粒,转染至Hep3B细胞,经G418筛选,建立稳定过表达HLA-G的肝癌Hep3B细胞。Real-time PCR及Western blotting检测肝癌Hep3B细胞HLA-G mRNA及蛋白质水平的表达。分析肝癌Hep3B细胞HLA-G过表达及HLA-ABC抗体封闭靶细胞相应位点对NK细胞体外杀伤作用的影响。结果:经酶切及测序鉴定证实,插入序列与设计的序列相符。Real-time PCR和Western blotting结果均表明,转染重组质粒的Hep3B细胞HLA-G过表达(P<0.01)。NK细胞对转染pEGFP-C1-HLA-G的Hep3B细胞杀伤作用明显降低(P<0.01),HLA-ABC单抗封闭靶细胞相应位点后,NK细胞对Hep3B、Hep3B-GFP和Hep3B HLA-G细胞的杀伤均增加(P<0.01)。结论:pEGFP-C1-HLA-G表达载体可有效增加HLA-G表达,HLA-G过表达可以削弱NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应。HLA-ABC单抗封闭靶细胞相应位点后,NK细胞对靶细胞的杀伤能力普遍有所提高。

摘要：目的构建表达人类白细胞抗原-G（HLA—G）基凶shRNA载体，探讨其对自然杀伤细胞（NK）细胞杀伤效应的影响。方法构建4个HLA—G—shRNA真核表达质粒，转染至Huh7细胞。检测HLA—GmRNA及蛋白质水平的表达。将NK-92MI细胞与靶细胞共同培养，以LDH释放法观察不同效靶比时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应。结果经酶切及测序鉴定证实，插入序列与设计的序列相符。RealTime—PCR和Western-blot结果均表明重组载体抑制了Huh7细胞HLA-G基因的表达。NK-92MI细胞对转染HLA—G的shRNA的Huh7细胞杀伤作用明显升高（P〈0．01）。封闭NK-92MI细胞ILT2受体后，杀伤作用降低（P〈0．01）。结论HLA—GshRNA可以增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应。

摘要：背景:对聚乙二醇-聚乙烯亚胺进行半乳糖化修饰,可使其成为具有肝细胞靶向性的纳米基因载体半乳糖化聚乙二醇-聚乙烯亚胺[Galactosylated poly(ethylene glycol)-graft-polyethylenimine,Gal-PEG-PEI]。目的:合成Gal-PEG-PEI,考察其基本理化特征,为下一步的转染研究提供参考。设计、时间及地点:对比观察基因工程实验,于2007-10/2008-06在中山大学生物医学工程中心完成。材料:两步法合成Gal-PEG-PEI。方法:应用纳米粒径-zeta电位仪、透射电镜、凝胶阻滞实验和EB结合实验测定Gal-PEG-PEI与psiRNA复合物的理化性质,CCK-8法检测其细胞毒性,纳米复合物转染HepG2细胞并观察其转染效率。主要观察指标:Gal-PEG-PEI/psiRNA的粒径、zeta电位及形态;包覆效率;细胞毒性实验结果;肝脏靶向性转染结果。结果:Gal-PEG-PEI/psiRNA复合物的粒径随N/P的增大而减小,最小粒径为81.1nm,而zeta电位随Gal-PEG-PEI中氨基与psiRNA磷酸基比例的增大呈上升趋势;Gal-PEG-PEI对siRNA质粒有较好的包覆效率。Gal-PEG-PEI载体的细胞毒性小于聚乙烯亚胺而其转染效率高于聚乙烯亚胺。结论:成功合成Gal-PEG-PEI纳米基因载体,表现出良好的肝细胞靶向性,且细胞毒性较小。

摘要：目的构建表达人类白细胞抗原-G(HLA-G)基因shRNA载体,探讨其对NK细胞杀伤效应的影响。方法构建4个HLA-G-shRNA真核表达质粒,瞬时转染至人肝癌Bel-7402细胞,检测HLA-G mRNA和蛋白水平的表达。将NK-92MI细胞(效应细胞)与转染后的Bel-7402细胞(靶细胞)共同培养,以LDH释放法观察不同效靶比时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应。结果经酶切及测序鉴定证实,插入序列与设计的序列相符。RT-PCR和Western blot结果均表明重组载体抑制了Bel-7402细胞HLA-G基因的表达。NK-92MI细胞对转染HLA-GshRNA的Bel-7402细胞杀伤作用明显增强(P<0.01)。封闭NK-92MI细胞KIR2DL4受体后,杀伤作用减弱(P<0.01)。结论成功构建了HLA-G shRNA载体,下调HLA-G可以增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应,HLA-G与NK细胞表面KIR2DL4受体结合后,向NK细胞传递抑制效应。