摘要：背景:通过RNA干扰沉默特异性的肿瘤相关基因可以抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,为RNA干扰治疗恶性肿瘤提供了一条新的途径。但RNA干扰治疗的安全性如何?是否在沉默特定基因的同时对正常的机体产生危害?单位:三峡大学仁和医院耳鼻咽喉科。材料:实验于2005-11/2006-03在武汉大学医学部中心实验室(BSL-1)完成。主要实验材料:hMSCs(第3代)由北京科宇联合干细胞生物技术有限公司提供并授权使用。以metafectene(德国)为转染试剂。目的:观察靶向人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse tran-scriptase,hTERT)的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人骨髓间充质干细胞生长增殖的影响,探讨靶向hTERT的RNA干扰技术临床应用的安全性。设计:观察对比实验。方法:①shRNA质粒的设计、构建及实验分组:根据RNA干扰原理,实验分4组:利用构建的表达shRNA的靶向hTERT mRNA的真核表达质粒(shRNA1组),非特异性的shRNA真核表达质粒(shRNA2组),转染试剂组和正常培养液组处理细胞。②质粒转染:hMSCs细胞常规培养1d后进行转染。③MTT法测定细胞增殖活性:培养24,48,72h后采用酶联免疫监测仪测定492nm处各组吸光度A值。④反转录-聚合酶链反应:培养48h后用TRIZOL-Reagent一步法分别提取各组的总RNA。以常规培养的喉鳞癌Hep-2细胞为对照。以紫外分光光度计测量各组RNA的A260及A280的吸光度值。将RNA稀释后进行反转录,以凝胶成像系统对电泳产物进行照相。⑤端粒酶活性检测:细胞培养48h后用Roche Molecular Biochemicals公司端粒酶PCR ELISA试剂盒进行活性测定。主要观察指标:①转染24h后在共聚焦显微镜下检测荧光表达情况。②培养24,48,72h后测定492nm处各组吸光度A值。③倒置相差显微镜下观察各组细胞生长情况;苏木精-伊红染色进行形态学分析。④反转录-聚合酶链反应结果。⑤端粒酶活性检测。结果:①共聚焦显微镜下见shRNA1组、shRNA2组及转染试剂组有大量的细胞表达绿色荧光。正常培养液组未见表达绿色荧光的细胞。②相应时间点各组细胞生长增殖无明显差异(P>0.05)。③倒置显微镜下观察各组细胞呈长梭形纤维细胞样贴壁生长,未见明显形态变化。苏木精-伊红染色见各组细胞生长密度及形态无明显变化。④反转录-聚合酶链反应显示各组细胞均无hTERT mRNA的表达。⑤端粒酶活性检测为阴性。结论:靶向hTERT mRNA的shRNA对正常人骨髓间充质干细胞的生长增殖无明显影响,该方法对不表达hTERT的正常体细胞可能是安全的。