摘要：目的建立细胞培养液中常见细菌和真菌的多重荧光定量PCR检测方法,并进行验证。方法选取金黄色葡萄球菌NUC基因、生孢梭菌COLA基因和白色念珠菌ITS-2区段基因,分别设计1组引物及探针,并以辣椒UBI3基因作为外标基因,建立金黄色葡萄球菌、生孢梭菌和外标基因的三重反应体系及白色念珠菌和外标基因的两重反应体系。验证方法的引物特异性、线性范围、检测限、专属性、抗干扰性和精密性。采用建立的方法对100份293T细胞培养液样本进行检测,同时与普通PCR法进行比较。结果3对引物于不同退火温度(56、57、58、59℃)下均可扩增出对应3种菌约100 bp的特异性基因条带,大小与预期相符;3种菌标准品质粒在5.80×10^(6)~5.80×10^(2)copies/μL范围内,与Ct均呈良好的线性关系,标准曲线方程分别为:Y=-3.373 X+37.48、Y=-3.557X+36.59、Y=-3.536 X+39.78,R^(2)均>0.99,扩增效率均在90%~110%范围内;3种菌的检测限均为101CFU/mL;3种菌的引物及探针在易发生交叉反应的6种细胞基因组DNA上无特异性扩增;293T细胞、酵母菌、大肠埃希菌、支原体的基因组DNA对检测无影响;重复性和中间精密性验证CV均<15%。100份细胞培养液样本中,检出14份阳性及86份阴性样本,随机挑选的3个阳性和2个阴性样本普通PCR法检测结果与建立的方法一致。结论建立的用于检测细胞培养液中细菌、真菌的多重荧光定量PCR法具有良好的专属性、抗干扰性和精密性,且简便易操作、成本低、灵敏度高,可快速检测细胞培养过程中的污染情况。

摘要：目的 建立端粒酶活性的多重荧光定量PCR(Taqman探针)检测方法,并进行验证。方法 针对端粒酶催化亚基(telomerase reverse transcriptase,TERT)的CDS序列设计特异性逆转录引物、2对定量引物及探针。优化反应体系中的逆转录引物(特异性逆转录引物和随机引物)及定量引物(2对定量引物探针单独及混合使用),与内参基因GAPDH引物和探针在单管中进行多重荧光定量PCR反应。用293T及MRC-5细胞分别制备端粒酶阳性标准品及阴性标准品,并验证方法 的稳定性及精密性。采用建立的方法 检测19份正常间充质细胞样本和32份乳腺癌细胞样本的端粒酶活性。结果 最佳反应体系为:以特异性逆转录引物合成的cDNA为模板,将TERT基因2对定量引物和探针混合后与内参基因GAPDH引物和探针在单管中进行多重荧光定量PCR反应。优化后大幅提高了体系的灵敏性,TERT荧光信号量(2Rn)增强了3倍。阳性标准品TERT基因扩增曲线正常,且与GAPDH基因之间的2Ct保持稳定;阴性标准品GAPDH基因扩增曲线正常,无TERT基因扩增曲线。反复冻融;3及5次阳性标准品的TERT与GAPDH基因之间的ΔCt与未冻融过的阳性标准品比较,差异较小;组内和组间精密性CV均<1%。19份正常间充质细胞样本端粒酶活性均为阴性,32份乳腺癌细胞样本端粒酶活性均为阳性,两者TERT基因的Ct值差异有统计学意义(t=4.236,P <0.001)。结论 建立的端粒酶活性多重荧光定量PCR(Taqman探针)检测方法 具有良好的稳定性及精密性,有望应用于肿瘤早期诊断和基因治疗。

摘要：构建了一种可同时对多个位点进行基因分型的新型通用探针连接酶检测方案．与普通的连接酶检测方案相似．具有灵敏度高和特异性强的特点．但降低了50％～90％的探针设计与合成成本。利用该方案对115例正常中国人的细胞色素P450系统的6个位点进行基因分型．样本测序与基因频率的统计学分析验证了该方案准确可靠。

摘要：目的:为提高COVID-19检测灵敏度,减少新冠患者临床假阴性检测结果,本研究建立了一种SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA捕获方法。方法:利用链霉亲和素磁珠,设计并合成生物素探针捕获SARS-CoV-2假病毒RNA;对磁珠用量、生物素探针浓度和洗脱次数等捕获条件进行了优化;参考WHO发布的序列,针对SARS-CoV-2病毒基因组的ORF1ab基因和N基因序列合成引物和TaqMan探针,对捕获的SARS-CoV-2假病毒RNA进行反转录实时荧光定量PCR检测。采用一步法和分步法检测、单重和多重实时荧光定量PCR检测,并分别比较检测结果。结果:本研究设计的生物素探针能富集到距离探针结合位点至少1.8 K处的序列,在生物素探针浓度12.5μM,磁珠的工作浓度333.33μg/mL时,合并RNA的两次洗脱液,对低拷贝病毒RNA的捕获效率最高。研究得到对低拷贝病毒RNA分步法比一步法、多重比单重实时荧光定量PCR检测更灵敏,进行分步法、多重实时荧光定量PCR检测限低于10 copies/μL,组间和重复实验组之间CT值变异系数均小于1%。所有阴性对照样品在检测中均为阴性。结论:本研究优化的链霉亲和素磁珠-生物素探针捕获法是富集SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA的有效方法,其抽提RNA病毒的结果优于一些商业化试剂盒,分步法、多重实时荧光定量PCR对SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA实现了高效检测,这为临床检测低拷贝RNA病毒提供了一种参考方案。

摘要：目的:建立一种快速、灵敏的方法检测人源异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)中小鼠细胞的浸润比例,以确保PDX模型的保真性。方法:选择人和小鼠的特异性基因PSMB2、Ren 2的部分区段设计引物和探针,利用多重荧光定量PCR(TaqMan探针法)在单管中检测PDX模型中小鼠-人细胞的相对量。另外,构建了不同浸润比例的标准品作为阳性对照,根据标准曲线进行样本比例计算。结果:建立了一种多重荧光定量PCR检测PDX模型小鼠细胞浸润比例的检测方案,该方案显示,PDX模型中不同比例的人鼠混合样本与△Ct值(Ct(小鼠)-Ct(人))之间线性关系良好,相关系数r~2为0.9998。利用该方法对14个样本进行检测,结果表明在绝大部分样本中小鼠细胞的比例低于30.00%,平均小鼠细胞比例为13.38%。结论:本研究建立的多重定量PCR检测PDX模型中小鼠细胞浸润比例的方法能够根据△Ct值快速、准确推断PDX模型中人、小鼠细胞的比例。该方法操作简单、耗时短、结果可靠,是一种快速、灵敏的PDX模型的质控方案。

摘要：本文针对某油泵的非标准试验设备设计工作,技术人员根据被试产品的主要技术参数,怎样设计试验设备总体框架图、功能原理图,从要实现具体功能上考虑主要零部件的设计、外购成件的计算选型等。本文对从事相似行业的技术人员设计非标准试验设备有重要借鉴意义。

摘要：近年来,DNA分子跟踪食物链技术发展迅速并逐渐成为脊椎动物与无脊椎动物食物链研究的新型模式。该技术通过对捕食者肠道或粪便中DNA的鉴定,判别所取食的猎物种类,其主要流程包括PCR引物设计、交叉特异性验证、室内测试、田间样本采集与保存、野外标本测试与结果分析等。该文介绍了食物链DNA跟踪技术的发展历程,对捕食者猎物结构、被捕食者天敌种类与猎物可检测时间等三个主要问题进行综述,并提出该技术的局限性与未来发展的方向。

摘要：本文主要阐述根据试验设备供油系统压力、流量等技术参数,确定管道材料、内径、壁厚的设计方法。规范了非标准试验设备液压管路设计标准,为相似行业人才培养明确设计流程、提供技术支持、奠定理论基础。

摘要：目的从东方田鼠的部分BAC文库中筛选微卫星。方法应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记。结果以地高辛标记的寡聚核苷酸(CA)20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂交信号最强的20个阳性克隆。再将这20个阳性克隆分别通过链霉亲和素磁珠法构建亚克隆文库,从中选取400个经PCR鉴定为阳性的亚克隆进一步测序分析,共得到220个微卫星序列,阳性率55%。选取重复次数高,侧翼序列完整的微卫星序列设计74对引物,共有35对引物能扩增出清晰的条带,其中16对引物具有多态性。结论成功且高效地从阳性BAC克隆中筛选出微卫星序列,这些微卫星和阳性BAC克隆可用于后续的定位研究。

摘要：通过设计通用荧光PCR引物并结合DNA测序系统建立了小鼠的多重STR分型方案。实验针对小鼠基因组设计了两对不同的通用引物序列,标记了FAM荧光的通用序列和"加尾"的位点特异性引物共同用于小鼠的多重PCR的STR基因分型。本研究优化了通用引物和特异性引物间的比例,优化了多重STR-PCR的反应条件,并最终利用该技术方案实现了五重STR分型。实验验证了该方案在多重STR分型中的可行性。与传统的荧光检测PCR产物方案相比,应用通用方案完成多重PCR反应大大节省了实验时间与经费。