摘要：【目的】克隆德州驴血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因,对其进行原核表达及多克隆抗体制备,同时检测HO-1基因在德州驴不同组织中的表达情况,为后期研究HO-1基因功能提供支撑材料。【方法】参考GenBank中公布的马HO-1基因序列(登录号:XM_023631135.1)设计特异性引物,从驴原代肺泡巨噬细胞(donkey primary alveolar macrophages,DPAMs)中提取RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增HO-1基因编码区(coding sequences,CDS),对测序所获序列与其他物种进行相似性比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对HO-1基因编码蛋白进行生物信息学分析。将HO-1基因序列克隆至pCold-SUMO载体进行原核表达,经镍柱亲和层析纯化后,以重组的HO-1蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blotting检测多克隆抗体特异性及与抗原结合的最大稀释度。利用免疫组化试验检测德州驴4种组织中HO-1蛋白的表达水平。【结果】德州驴HO-1基因CDS区全长873 bp,编码290个氨基酸,其氨基酸序列与马的相似性最高,亲缘关系最近,与鸡的相似性最低,亲缘关系最远。德州驴HO-1蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白,分子质量为33.04 ku,无信号肽,存在1个跨膜区,二级结构以α-螺旋为主。ELISA、Western blotting结果显示,针对HO-1制备的多克隆抗体与HO-1结合最大的稀释度为1∶102400,宿主HO-1蛋白可被制备的多克隆抗体识别。免疫组化结果显示,德州驴4种组织中均有效表达HO-1蛋白。【结论】本研究成功获得德州驴HO-1重组蛋白,并制备特异性多克隆抗体,为后续深入探究HO-1基因在马属动物感染病原过程中的作用提供参考依据。

摘要：马疱疹病毒8型(EHV-8)是近年来在规模化养驴场发现的一种病毒,其主要导致马属动物呼吸困难、繁殖障碍(流产、产弱驹等),严重危害养驴业的健康发展。为建立EHV-8的分子生物学检测方法,用于该病原感染的流行病学调查和致病机制研究,根据NCBI数据库中EHV-8参考毒株ORF 70基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化程序,建立检测EHV-8的荧光定量PCR方法。结果表明,该方法灵敏度高,最小检测浓度为100拷贝/μL,灵敏度是常规PCR的100倍;特异性强,与EHV-1、EHV-4均无交叉反应;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.15%~0.83%和0.06%~0.47%。利用新建立的方法对120份临床驴血样本进行检测,阳性检出率为32.5%,研究结果为EHV-8的检测和致病性研究提供了可靠的技术支撑。