摘要：【目的】探索重叠延伸PCR法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况,确定点突变位点。根据扩增得到的PlxyCSP1序列设计并合成重叠引物,利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1上的Cys32突变成色氨酸(Trp32),获得突变体PlxyCSP1-M。将突变后的基因与载体pET-32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】分子对接图显示,配体可以顺利进入PlxyCSP1的结合口袋,而无法进入PlxyCSP1-M的结合口袋。结合能预测显示,配体化合物与PlxyCSP1的结合能均为正值,与PlxyCSP1-M的结合能均为0。突变后的重组质粒测序结果表明,Cys32(TGC)已突变为Trp32(TGG),经IPTG诱导,该菌表达了分子质量约为36 ku的融合蛋白。【结论】Cys32是影响PlxyCSP1结构和功能的重要氨基酸残基。Cys32突变为Trp32后,PlxyCSP1-M结合特性发生了变化,不能与配体化合物正常结合。

摘要：昆虫组织蛋白酶B(Cathepsin B)在昆虫发育和代谢过程中发挥重要作用。本研究首先克隆了草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(***)的组织蛋白酶B基因Cathepsin B(SCB),获得其开放阅读框(ORF)序列(Gen Bank登录号:HQ110064)。生物信息学分析表明,该基因的开放阅读框包含1 026 bp的片段,编码341个氨基酸,预测N-末端含有长度为20个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为35.6 k D,等电点为6.59。氨基酸序列与15种物种Cathepsin B比较有51.2%-96.2%的一致性,与甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hiibner)相似度最高,达96.2%。利用同源建模预测SCB的三维结构,经动力学的优化,SCB折叠成紧密而稳定的球状结构,含6个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白表面。同时分子对接模拟结果表明,SCB结合口袋比较浅,形状不规则,袋口较宽。ARG19、VAL23和ASN24为活性位点关键氨基酸残基,抑制剂CA与SCB活性位点3个关键氨基酸残基有较强的相互作用,且均主要表现为静电相互作用能,其中VAL23、ASN24与CA形成氢键。以期为进一步运用生物实验手段研究Cathepsin B的结构和功能,设计和开发昆虫组织蛋白酶类抑制剂类杀虫剂奠定基础。

摘要：【目的】克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的组织蛋白酶L(cathepsin L,CatL)基因,分析该基因的序列特征并制备该酶多克隆抗体,为探析其生理功能奠定基础。【方法】根据甜菜夜蛾Spodoptera exigua的组织蛋白酶L基因开放阅读框(ORF)序列两端直接设计引物克隆草地贪夜蛾组织蛋白酶L基因。利用生物信息学软件分析该基因的序列特征,利用ClustalX2软件进行同源比对和进化分析,利用同源建模预测该酶三维结构。通过原核表达重组蛋白,多次免疫新西兰大白兔制备该酶多克隆抗体。【结果】克隆获得了草地贪夜蛾的组织蛋白酶L基因SfCatL(GenBank登录号:HQ110065),ORF序列长1 035 bp,编码344个氨基酸,预测N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.8 kD,等电点为6.69。SfCatL氨基酸序列与其他13个物种的组织蛋白酶L氨基酸序列比较有53.7%~96.8%的一致性,与甜菜夜蛾组织蛋白酶L氨基酸序列一致性最高,达96.8%。同源建模预测表明,SfCatL折叠成紧密而稳定的元宝状结构,含3个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白的表面。原核表达、纯化SfCatL蛋白制备抗血清,其效价超过1∶40 000,Western blot鉴定结果表明抗血清与草地贪夜蛾Sf9细胞SfCatL蛋白能够特异性结合。【结论】获得了草地贪夜蛾SfCatL完整ORF序列,分析了其特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,成功获得多克隆抗体。本研究为进一步研究该基因的功能并开发组织蛋白酶抑制剂类杀虫剂提供理论依据。

摘要：以涂布法和富集培养法筛选得到降解菌株HQ-C-01,该菌株在48 h时对50 mg/L克百威、甲萘威、茚虫威和仲丁威的降解率分别可达95.2%、99.0%、85.0%和67.5%.确定菌株HQ-C-01的C、N、P源化合物为葡萄糖、蛋白胨和磷酸氢二钾,采用中心组分设计法确定了菌株HQ-C-01的培养基最适C、N、P源配比为葡萄糖32.10 g/L、蛋白胨3.25 g/L、磷酸氢二钾1.50 g/L;在最佳培养基条件下,D590 nm实测值为0.786 5,与期望值0.805 4接近,48 h时对50 mg/L克百威降解率为95.9%.

摘要：利用微波系统从蓖麻饼中提取蓖麻碱,考察了料液比、颗粒度、提取温度、提取时间及微波功率等因素对蓖麻碱提取率的影响规律,通过单因素分析和正交试验设计确定了最佳提取工艺条件。确定的最佳提取工艺条件为:料液比1∶50;提取温度100℃;提取时间20 min。

摘要：和谐作为一种思想,是中华民族传统文化精神的精髓。中华文化的和谐精神可以归纳为“和而不同、求同存异”。所谓“和谐”,即为“配合得适当和匀称”。这就是说,和谐不是指完全统一,而是指事物协调、均衡、有序的发展状态。具体延伸到学校,延伸到课堂,主要是指课堂里学生协调、均衡、有序发展的态势。如教学中,民主融洽的师生关系,以学定教、顺学而导的教学艺术,教师、学生、文本的平等对话等等,都是和谐课堂的重要体现。近年来,贵溪市实验小学,乘着课改的春风,用“构建和谐课堂、张扬学生个性”的育人思想实践教育教学改革,教育教学质量稳步提升,从而使学校迈入和谐发展的快车道。对“和谐课堂”的理解,贵溪市实验小学的教师们认为:学生进课堂以前和出课堂的时候有了变化,是一节扎实而有效率的课,这样的课堂应是“和谐的课堂”;课堂上不完全是预设的,在教学过程中既有资源的生成,又有过程状态生成,是一节丰实的课,这样的课堂是“和谐的课堂”;只要是一心为孩子、为学生上课,而不是上给其他听课的人听的,是一节平时都能上的家常课,这样的课堂是“和谐的课堂”;课堂上虽有缺憾但又努力完善着,是一节真实的课,这样的课堂也是“和谐的课堂”……