摘要：目的初步探究布鲁氏菌外膜蛋白16、19脂化型重组蛋白(L16、L19)对人单核细胞白血病细胞系(THP-1细胞)免疫调控因子表达的影响。方法以佛波酯(PMA)活化的THP-1细胞为体外实验细胞模型,采用成组设计,分别将L16、L19与THP-1细胞共培养(L16刺激组、L19刺激组),并以PMA活化的THP-1细胞为对照组。共培养4 h时,分别采用免疫荧光染色(IFS)法和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测L16、L19是否进入细胞。共培养12、24 h时,实时荧光定量PCR法测定干扰素调节因子1(IRF-1)、Ⅱ类主要组织相容性复合物反式激活蛋白(CⅡTA)mRNA表达水平;Western blot法检测T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)和γ干扰素受体1(IFNGR1)蛋白表达水平。结果共培养4 h时,可见L16、L19分别进入L16、L19刺激组THP-1细胞内。共培养12 h时,L16刺激组IRF-1 mRNA表达水平(0.16±0.15)明显低于对照组(1.00±0.00,P0.05)。Western blot结果显示,共培养12、24 h时,对照组、L16刺激组、L19刺激组INFGR1、Tim-3蛋白表达水平比较,差异均有统计学意义(F=50.92、6.80、148.73、156.57,均P<0.05)。其中,共培养12 h时,L16、L19刺激组INFGR1蛋白表达水平均明显低于对照组,且L19刺激组高于L16刺激组(均P<0.05);而L19刺激组Tim-3蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)。共培养24 h时,L16、L19刺激组INFGR1蛋白表达水平均低于对照组,且L19刺激组高于L16刺激组(均P<0.05);而L16刺激组Tim-3蛋白表达水平高于对照组和L19刺激组(均P<0.05)。结论布鲁氏菌L16可以下调THP-1细胞IRF-1、CⅡTA mRNA表达水平;L16、L19均能够下调IFNGR1、上调Tim-3蛋白表达水平。

摘要：目的观察布鲁菌外膜蛋白(OMP)16脂化型(L16)和非脂化型(U16)对成骨细胞的毒力效应。方法利用大肠埃希菌BL21(DE3)原核表达系统制备L16和U16重组蛋白,并使用镍柱纯化。采用成组设计,利用小鼠成骨细胞系(MC3T3细胞)分别与L16和U16重组蛋白共孵育(L16、U16刺激组),以布鲁菌脂多糖(LPS)刺激物为阳性对照(LPS对照组),未加任何刺激的细胞作为阴性对照,孵育时间为24 h。CCK-8法检测MC3T3细胞的活力;离心收集培养细胞上清,生物发光法测定上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放率,评价L16和U16对MC3T3细胞的毒力作用;进一步使用AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染流式细胞术检测MC3T3细胞的凋亡率,以及通过免疫印迹法(WB)检测凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平。结果L16刺激组细胞活力[(56.16±1.63)%]显著低于U16刺激组和LPS对照组[(97.02±1.44)%、(98.64±0.90)%,P均<0.01],LDH释放率[(84.64±0.96)%]显著高于U16刺激组和LPS对照组[(34.82±3.41)%、(26.75±1.95)%,P均<0.01]。AnnexinⅤ-PE/7-AAD染色结果显示,L16刺激组细胞凋亡率为(46.45±2.19)%,而其余组均<1%。WB结果显示,L16刺激组细胞内存在活化的Caspase-3,而U16刺激组和LPS对照组未检测到此活化片段。结论L16能诱导成骨细胞的凋亡,使成骨细胞的增殖受到抑制,而U16的作用不明显,具备完整脂化结构的布鲁菌L16是毒力效应所必需的。