摘要：背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常。神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体。目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达。设计:细胞-基因学观察。材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠。方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液。取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCl中制备JetPEI/DNA复合体。用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×108L-1,向24孔板中每孔加入400μL细胞悬液、100μLJetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中,分别于转染24,48,72h后收集神经干细胞。主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达。结果:转染24h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%。各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24h条带亮度较低,72h时外源基因表达水平最高。结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达。

摘要：目的探讨STAT3基因小发夹RNA(shRNA)表达质粒对胃癌MKN-45细胞STAT3基因的干扰作用。方法根据STAT3 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒(psiRNA-H1/STAT3),使用脂质体转染人胃癌细胞系(MKN-45细胞)。实验分为对照(A)组,psiRNA-H1转染(B)组和psiRNA-H1/STAT3转染(C)组。通过RT-PCR和Western Blot检测STAT3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达的影响。结果psiRNA-H1/STAT3经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确,并经测序证实。将其成功转染MKN-45细胞后,该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。结论将成功构建的针对STAT3基因的shRNA表达载体转染MKN-45细胞,能有效抑制该细胞的STAT3 mRNA和蛋白表达,为STAT3基因靶向治疗提供一定的实验依据。

摘要：目的构建信号传导及转录活化因子3(STAT3)基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,探讨STAT3抑制后对胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法根据STAT3 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒(psiRNA-H1/STAT3),使用脂质体转染MKN-45细胞,实验分为对照组、psiRNA-H1转染组和psiRNA-H1/STAT3转染组。通过RT-PCR和Western blot检测STAT3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT3 mRNA和蛋白表达的影响;MTT比色法检测细胞的生长抑制率;采用流式细胞术检测转染后对MKN-45细胞凋亡的影响;采用Boyden小室侵袭实验检测转染后MKN-45细胞侵袭力的变化。结果成功转染重组体的MKN-45细胞中STAT3 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05)。psiRNA-H1/STAT3转染组各时相均明显抑制MKN-45细胞生长,且MKN-45细胞凋亡率为34.26%,相比对照组(3.75%)和psiRNA-H1转染组(4.43%)明显升高(P<0.01)。另外,psiRNA-H1/STAT3转染组MKN-45细胞侵袭力较另外2组明显减弱(P<0.01)。结论成功构建了针对STAT3基因的shRNA表达载体,通过转染MKN-45细胞,在体外能有效抑制人胃癌细胞STAT3mRNA和蛋白表达,细胞增殖、侵袭能力减弱并且促进细胞凋亡,为STAT3基因靶向治疗提供一定的实验依据。