摘要：目的利用实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)建立支原体的快速检测方法。方法选择欧洲药典10.0版2.6.7规定可用于验证的8种支原体,根据支原体16S RNA序列设计特异性引物,建立支原体qPCR检测方法,并验证其特异性、灵敏度和重复性。结果成功筛选出采用qPCR检测支原体的合适引物,8种支原体在浓度为10^(5)~10^(6)CFU/mL时,循环阈值(cycle threshold,CT)在20~30,相同浓度的细菌对照无CT。除精氨酸支原体的可检测浓度为10~100 CFU/mL外,其他7种支原体可检测浓度均达到10 CFU/mL,10 CFU/mL的支原体CT在35~40之间。特异性检测实验重复3次,对照细菌全部未检出,10^(5)~10^(6)CFU/mL的上述8种支原体CT均在20~30,每种支原体3次特异性数据变异系数均小于10%。灵敏度实验重复3次,每次实验各支原体不同稀释浓度CT维持在20~40,变异系数均小于10%。结论建立的支原体检测qPCR方法特异性较好、灵敏度较高且重复性较好,可为生物制品中可能存在的支原体污染风险的及时控制提供帮助。

摘要：目的:白细胞介素(IL)-33具有重要的免疫调控作用,在疾病中扮演着重要的角色。本文旨在通过基因优化实现IL-33在哺乳动物细胞中的高效表达,为疾病机理研究以及疫苗免疫佐剂应用等提供基础。方法:根据小鼠白细胞介素-33成熟肽(m IL-33)的氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成优化的m IL-33基因片段,通过搭桥PCR将编码人CD8α信号肽的核酸序列分别与优化或未优化的m IL-33基因连接,并与绿色荧光蛋白(EGFP)基因分别构建到双表达单元质粒p Bud CE4. 1的不同启动子下;重组质粒经lipofectamine 3000和PEI转染293FT细胞;以Western blot和ELISA检测重组蛋白的表达;收集表达的m IL-33刺激巨噬细胞Raw264. 7,ELISA检测培养上清的TNFα水平,以证明IL-33的生物学活性。结果:重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功; lipofectamine 3000转染效率较PEI转染更高; Western blot和ELISA结果显示密码子优化的m IL-33表达水平较未优化序列更高,在EF-1α启动子和CMV启动子指导下m IL-33在293FT细胞表达水平相当,CD8α信号肽成功引导m IL-33的分泌,产物具生物学活性。结论:密码子优化操作显著改善了m IL-33在哺乳动物细胞中的表达水平,为进一步研究奠定了基础。

摘要：细菌外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性菌以出芽方式分泌的一种蛋白脂质体,可通过基因工程改造成为外源大分子抗原蛋白的载体。成孔蛋白细胞溶素A(Cly A)可作为引导序列将C-端融合的外源蛋白质定位在菌体及其所分泌的OMVs外膜上。利用Cly A融合蛋白重组的OMVs可介导抗原呈递,制备疫苗。为验证这一假说,本研究拟以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为目的蛋白,采用重组技术,构建Cly A-EGFP融合蛋白表达载体,转化*** DH5α,获得Cly A-EGFP融合蛋白整合的重组细菌OMVs,探索Cly A/EGFP融合蛋白整合的OMVs作为一种制备新型疫苗载体的可行性。重组OMVs分别经蛋白酶K和/或EDTA处理后,蛋白质印迹分析显示,Cly A-EGFP融合蛋白有效地整合在重组的OMVs中,且EGFP呈现于表面。重组OMVs与小鼠巨噬细胞Raw264.7共同孵育后,以EGFP作为标记,荧光显微镜观察显示,OMVs可被巨噬细胞吞噬、摄取。进而,荧光显微镜及流式细胞术分析证明,重组的OMVs可被骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)有效摄取,并促进BMDCs表达CD86和CD80,说明重组的OMVs可激活树突状细胞,促进其成熟。本研究结果提示,利用Cly A融合特异目的蛋白整合的重组OMVs,可作为外源蛋白质的载体,介导抗原呈递作用,在设计与制备疫苗中具有潜在的应用价值。