摘要：目的建立一种可快速、全面、准确检测人感染札如病毒的Taq Man探针荧光实时RT-PCR方法。方法利用Bioedit2.0、MAGE6.0软件对可感染人的GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤ基因群札如病毒进行保守序列比对,应用Primer6.0、Primer Express 3.0进行引物和Taq Man探针的设计与评价,分别设计了两套引物及Taq Man探针,克隆相应靶基因并构建阳性标准品,建立及优化一步法实时荧光RT-PCR反应体系,并进行灵敏度、特异度、临床标本验证试验。结果根据基因序列比对分析,札如病毒ORF1与ORF2连接区具有相对高保守序列,针对GⅠ、GⅡ、GⅣ及GⅤ设计了一条共用的下游引物、以及两套上游引物和Taq Man探针,能覆盖当前GenBank可见的感染人的札如病毒基因型,在同一反应管中建立了同时检测札如病毒四个基因群的实时荧光RT-PCR,并可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ进行初步分型,对人柯萨奇病毒、诺如病毒、轮状病毒、腺病毒等非靶标病原体无扩增,仅对札如病毒有特异扩增,最低检测下限为10拷贝/反应。结论本研究建立了札如病毒一步法实时荧光RT-PCR反应体系,可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ区分开来,为腹泻疫情防控和风险评估提供快速、准确的病原学依据。

摘要：目的 建立H5N6禽流感病毒TaqMan-MGB探针双重实时荧光RT-PCR,用于疑似病例快速诊断及活禽交易市场外环境监测.方法 根据GenBank中H5N6禽流感病毒HA和NA高保守序列设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化双重实时荧光RT-PCR体系,进行特异性、灵敏度、重复性试验,并在临床应用中与商品化试剂盒比较.结果 H5N6双重实时荧光RT-PCR体系可在80 min内完成检测,与其它亚型流感病毒及常见呼吸道病原体无交叉反应,最低检测限达到10拷贝/反应,H5和N6靶基因标准曲线的相关系数R2分别为0.999和0.993,Ct值的变异系数分别为0.151％-0.549％和0.213％-0.575％,验证试验的阳性和阴性符合率均为100％.结论 H5N6禽流感病毒TaqMan-MGB探针双重实时荧光RT-PCR特异、灵敏、稳定,可在疑似病例的早期快速应急检测及活禽交易市场外环境持续性监测方面具有较好的应用价值.

摘要：大量技术研究结果显示,对开采沉陷发生程度的预计和分析,不仅是科学有效评价分析采动损害事件发生程度,以及选择确定采动损害事件控制措施的前提,还是开展煤矿开采生产方案设计优化工作,土地复垦工作,以及地基稳定性评价工作过程中需要依赖的基本条件。围绕煤矿开采沉陷预计理论与方法研究评述,展开了简要的阐释分析。

摘要：目的建立快速、灵敏、特异的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR体系,用于食源性致病菌监测和淡水鱼产品贸易往来的快速检测。方法根据GenBank公布的香港海鸥形菌16SrRNA基因高保守序列,设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,建立和优化快速检测体系,评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性,并在淡水鱼类、急性胃肠炎腹泻患者标本中临床应用,结合细菌分离方法和序列测定分析进行验证。结果建立的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应体系检测时限短,仅40min就可出结果,特异性好,与沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等非目标菌无交叉反应,灵敏度高,检测下限达10拷贝/反应,稳定性好,同一浓度阳性质粒进行16次重复检测的Ct值变异系数0.183%。92份淡水鱼及211份医院急性胃肠炎腹泻标本实时荧光PCR与常规细菌分离结果完全一致,均检出了12株香港海鸥形菌,16SrRNA测序结果显示与HKU1株同源性在99.5%以上,进一步验证了实时荧光PCR的特异性。结论本研究建立的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应体系快速、特异、灵敏,在防止食源性疾病的传播和加快贸易通关速度方面,具有较强的的应用价值。