摘要：背景:RNA干扰技术的应用,关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞,目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。设计、时间及地点:开放性实验,于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。材料:穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品;AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystem sInc.(Canada)公司产品。方法:选择针对甲胎蛋白mRNA的特异性小干扰RNA靶序列,设计合成为相应的双链DNA,并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接,构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒。主要观察指标:对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。结果:构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析,证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功,测定滴度为1.4×109nfu/L。结论:实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。

摘要：背景:研究发现,Lewis血型抗原与多种恶性肿瘤关系密切,岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUTs)是参与合成Lewis抗原的关键酶,FUT3是其中之一。目的:设计并构建靶向FUT3基因的miRNA干扰质粒,为探索肿瘤基因治疗新途径奠定基础。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-05/10在济南市中心医院医学实验诊断中心完成。材料:BLOCK-iTTM PolⅡmiR RNAi Expression Vector Kits(含荧光基因GFP)、T4DNA连接酶购自invitrogen公司;大肠杆菌菌株One Shot TOP10购自invitrogen公司。方法:根据GenBank中FUT3的序列,应用***网站的设计软件设计、合成针对FUT3 miRNA的相应Oligo DNA,退火后与BLOCK-iTTM Pol ⅡmiR RNAi Expression Vector相连接,转化感受态***10。主要观察指标:①重组质粒DNA序列分析。②质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。③紫外分光光度计检测。④聚合酶链反应鉴定。结果:经测序鉴定和聚合酶链反应鉴定证实成功构建针对人FUT3基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-FUT3-miR;质粒DNA的琼脂凝胶电泳检测和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可以用于后续试验。结论:FUT3靶向miRNA表达载体构建成功。

摘要：目的构建针对人甲胎蛋白(AFP)基因的miRNA表达质粒,为进一步研究AFP基因功能奠定基础。方法沿mRNA序列寻找连续两个AA及后面的19个核苷酸,通过同源性比较,选择与其他任何基因无同源性的序列即作为潜在的miRNA靶位点,针对AFP基因的编码序列体外合成两段互补的寡核苷酸,与线性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR RNAi EXPRESSION VECTOR载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、PCR及基因测序鉴定其相对分子质量及插入片段的序列。结果纯化质粒的相对分子质量为5.8 kb,PCR鉴定结果符合目的条带(260 bp左右)大小,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。结论成功构建了针对人AFP基因的miRNA表达质粒。