摘要：目的表达与纯化去唾液酸糖蛋白(ASGPR),为后续作为糖识别工具研究糖基化修饰的功能奠定基础。方法选择Nde I和Xho I作为限制性内切酶切割位点,使用SnapGene设计的上下游引物,以cDNA为模板,通过PCR扩增ASGPR基因。将扩增产物与经酶切的质粒pET-30a(+)使用一步克隆试剂盒进行重组。将重组产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中,随后,将转化后的细菌溶液涂布在含有卡那霉素的LB平板(LBK板)上,以筛选出抗性菌落。之后,提取质粒并将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3),筛选出抗性菌落,并进行测序验证。随后,进行ASGPR的小量诱导和蛋白的大量表达,接着进行蛋白包涵体复性过程。最后,收集不同的肿瘤细胞裂解液作为样品,利用纯化后的ASGPR蛋白作为糖识别工具,通过免疫印迹实验验证ASGPR的糖结合活性。结果重组质粒pET-30a(+)-ASGPR构建成功,通过免疫印迹实验证明ASGPR具有对GalNAc末端糖基化修饰的结合活性。结论基于O-GalNAc修饰(Tn抗原)的变化与多种疾病密切相关,所以高纯度且具有结合Tn抗原的ASGPR在未来对研究这种修饰功能具有巨大的推动作用。

摘要：来自空肠弯曲菌的β1,3-半乳糖基转移酶(CgtB)主要负责蛋白质O-连接糖基化的第二步延伸,在O-连接N-乙酰半乳糖胺(O-GalNAc)修饰后面添加一个半乳糖,目前CgtB已经被广泛应用于体外O-连接糖基化的合成。为了开发O-GalNAc修饰的识别工具,CgtB蛋白质用于突变体设计。在基因水平删除N端30个氨基酸及C端的30个氨基酸得到Cgt1,将Cgt1构建在pMal-c5x表达质粒上并通过大肠杆菌进行原核表达。可溶性的Cgt1经过麦芽糖结合蛋白(MBP)亲和层析柱进行纯化并利用糖结合实验进行活性分析。结果显示,大肠杆菌体系可以成功表达可溶性重组Cgt1蛋白质,相对分子质量约为70000,重组的Cgt1具备结合O-GalNAc修饰蛋白质的活性;针对不同的标准糖蛋白,Cgt1只识别含有O-GalNAc修饰的黏蛋白(mucin);对于复杂的细胞样品,Cgt1可以特异性识别细胞内的O-GalNAc修饰。该研究开发的识别O-GalNAc修饰工具,为进一步研究O-GalNAc修饰的功能奠定了基础。