摘要：目的：建立优化的差示PCR条件；运用建立的条件分离胃癌GC7901与胃粘膜GES－1细胞株之间的差异表达基因；根据获取的序列，设计引物并运用于检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本，拟筛选出检出率与符合率高的数对引物，建立胃癌基因诊断方法．方法：LJGC7901与GES－1细胞株为研究对象，探索mRNA差示PCR的最佳反应条件，运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因；以回收的片段作探针，打点杂交证实为真正的差异片段后，对产物进行直接测序及同源性检索；设计引物，采用RT－PCR方法检测胃癌组织、血、活检胃粘膜标本．结果：优化的差示PCR条件为：前5轮PCR循环采用94℃35s，40℃2min，72℃30s，后35轮PCR循环采用94℃45s，55℃2min，72℃1min，最后在72℃延伸7min；分离回收差异条带154条，从中选出17个片段作探针，打点杂交证实在两细胞株之间呈差异表达；对17个片段进行了测序，其中17个新序列被GenBank接受，接受号为AF054162至AF054172，AF071052至AF071058；其中5个序列引物在26例胃癌标本中检出覆盖率为100％，在9例病理确诊的胃癌患者活检胃粘膜中检出率100％，在17例病理确诊为胃癌患者血标本中检出率为53％．结论：优化了mRNA差示PCR技术条件；分离出154个差异表达的基因片段；筛选出17个新序?

摘要：作者在计算机辅助设计下,利用DNA合成仪合成HIV env 125-1,HIV env 125-2两个寡核苷酸引物及HIV env 101-1寡核苷酸探针,以PCP技术扩增env 125肽基因。扩增产物经电泳和Southern杂交鉴定后克隆入pUC19中,筛选、鉴定后进行序列分析。结果表明,上述方法获得的env 125肽基因5’端插入了EcoRI酶切位点和起始码ATG,3’端插入了终止码TAG和HindⅢ酶切位点,且序列及读框正确。

摘要：作者设计了一对DNA引物,用于扩增1型人免疫缺陷病毒(HIV—1)gag基因的一段保守序列。应用聚合酶链反应(PCR)技术,采用含有ARV-2gag基因的亚克隆质粒pAG423作模板,可以使靶基因片段数目增加1×10~7倍以上,经电泳染色后,扩增产物清晰可辨。实验结果表明,这种方法的敏感性极高,足以检测到6.5个拷贝的HIV-1基因。用特异性DNA探针打点杂交证实扩增产物为特异性gag基因片段。实验还表明,经过30～35次PCR循环可以得到最佳扩增效果,而且应用PCR和打点杂交方法还可以对HIV-1基因进行定量分析。因而PCR是一种可以取代病毒分离的常规测定HIV-1感染的简便方法。

摘要：为寻找脑内新基因 ,以正常成人全脑cDNA为模板 ,采用锚定PCR方法进行扩增 ,将经琼脂糖DNA电泳鉴定获得的一约 12 0 0bp大小的特异性条带回收 ,并克隆入Teasy载体 .用 310GeneticAnalyzer进行自动测序 .所得序列进行生物信息学分析 :BLAST相似性分析结果证明所得序列为新序列 ,读框分析表明 ,该序列中存在一完整编码区 ,编码含 35 7个氨基酸的蛋白质 .ProDom软件分析发现其含有酰基携带蛋白 (ACP)样结构域 .随后 ,经 3′RACE法克隆到该基因的全长cDNA ,其全长为 2 0 2 4bp ,染色体定位在 14q11 2 ,含有 16个外显子 ,15个内含子 ,该基因已登录到GenBank .经设计编码区引物 ,从Teasy载体扩增出编码区后再克隆入pGEX 4T1表达载体 ,经异丙基硫代 D 乳糖苷 (IPTG)化学诱导表达 .其编码区克隆入 pGEX 4T1表达载体后 ,转入JM10 9宿主菌 ,经IPTG诱导已得到表达 .点杂交及RNA印迹表明 ,该基因在正常成人脑内广泛高表达 .

摘要：作者设计并合成了一对位于HIV-1pol基因、保守性很高的寡核苷酸引物,采用3温度点及2温度点聚合酶链式反应(PCR),以pARV-2/7A质粒为模板,扩增出360bp大小的片段.以pUC 19,pTTQ 18,M13mp18和外周血淋巴细胞(PBMCs DNA)为模板进行同步PCR,并用倍比稀释法将pARV-2/7A稀释后进行PCR,分别研究了该组引物的特异性和敏感性.结果表明:该套PCR试剂特异性强,敏感度高,能检出3个拷贝的HIV-1.

摘要：肽库是研究与特定靶分子高亲和结合配体的有力工具。肽文库可被分为合成肽文库和噬菌体肽文库两类。作者综述了噬菌体肽文库及其蛋白质结构域分析定位、疫苗研制及抗原表位分析和药物设计等方面的应用。

摘要：作者用计算机辅助分析和比较１６种ＨＩＶ－１和ＨＩＶ－２序列并设计了一对用于检测ＨＩＶ－ｌ和ＨＩＶ－２的通用ＰＣＲ引物ＰＧ０３和ＰＧ０４．它们在ＡＲＢ－２病毒序列上分别位于４５７～４７８和７６６～７９８位核苷酸。两引物在ＡＲＶ－２基因上指导合成一个长３４２ｂｐ的ＤＮＡ片段。用ｐＡＲＶ－２／７Ａ和含有ｇａｇ基因的亚克隆质粒ｐＪＧ４２３作模板，均可扩增出特异性靶基因序列，而用不含ｇａｇ基因的亚克隆质粒ｐＪＥ３３２，ｐＪＰ１６３和ｐＪＰ０３２作模板则无扩增产物。将ｐＪＧ４２３进行稀释，结果该ＰＣＲ法可检出少至数个拷贝的质粒ＤＮＡ，表明此法敏感性极高。作者用ＰＣＲ法还直接从ＨＩＶ阳性血清中检测出ＨＩＶ基因序列，而正常对照血清却不能扩增出ＰＣＲ产物。

摘要：本文在已克隆抗人ＣＤ３抗体ＶＨ和Ｖｋ基因的基础上，设计并合成了ＰＣＲ引物。两个外侧引物分别含有ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ酶切位点及起始码和终止码序列，４个内侧引物各含部分连接肽基因序列。用加端ＰＣＲ分别在ＶＨ基因３＇端和Ｖｋ基因５＇端延伸部分连接肽基因序列，回收后混合运火；应用重叠延伸拼接法，将ＶＨ和Ｖｋ基因通过Ｌｉｎｋｅｒ序列串联为单链抗体基因；利用ＰＣＲ产物两端预先设计的ＳａｌＩ和ＥｃｏＲＩ酶切位点，将其克隆到ｐＵＣ１９质粒中，筛选到阳性克隆。经双脱氧终止法序列测定：ＶＨ和ＶＫ基因及Ｌｉｎｋｅｒ序列均正确，为用基因工程技术生产单链抗体奠定了基础。

摘要：目的 构建竞争性定量PCR检测幽门螺杆菌(Hp)cagA基因的内参标模板并做序列测定。 方法 根据cagA基因及Lac Ⅰ蛋白的特异性结合部位的序列,设计二对PCR引物(cagAp1,cagAp2,cagAp3,cagAp4)。其中cagAp1及cagAp3用于扩增cagA基因2593～2788位碱基间196bp的片段,cagAp2及cagAp4用于扩增2789～2993位碱基之间204bp的核酸片段;在cagAp1的5′-端引入了BamHⅠ的限制性酶切位点,在cagAp2的5′-端结合了Sal Ⅰ的限制性酶切点。在cagAp3的5′-端引入Lac Ⅰ蛋白的特异性结合序列(21bp),在cagAp4的5′-端结合了cagAp3之5′-端21个碱基的反义DNA序列。利用重组PCR,将乳糖操纵子中Lac Ⅰ蛋白的特异性结合序列重组入cagA基因400Lp的片段中,得到cagA基因片段的重组体(rfcagA)。将重组rfcagA定向克隆入pUC19进行序列测定。 结果 用DNA序列分析仪双向测定rfcagA的序列,其含400bp的cagA片段及Lac Ⅰ蛋白特异性结合部位的序列(21bp),一级结构完全正确。 结论 内参标模板rfcagA构建,对竞争性定量PCR检测Hp cagA基因的方法的建立具有重要价值。

摘要：目的　从新鲜培养的解脲支原体 ( URA) 型培养液获得其 MB抗原主蛋白 N端 1 /3保守区的基因 ,并体外表达 ,获得具有抗原活性的原核表达蛋白 ,为研制广谱、低廉及方便准确的 URA感染的诊断及治疗方法提供物质基础。方法　从新鲜培养的 URA标准株 型培养液提取 DNA模板 ,采用特异引物及聚合酶链方法获得其 MB抗原主蛋白 N端 1 /3保守区的基因 ,经克隆入测序载体验证 DNA大小及序列后 ,将 MB抗原主蛋白 N端 1 /3保守区的基因克隆入高效原核表达载体 ,并在大肠杆菌中表达 ,初步以Western- blot测定表达产物的抗原性即与感染者阳性血清的反应活性。结果　以笔者设计的特异引物 ,能得到预期大小的 PCR产物 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列符合目的基因的序列 ,其插入原核表达载体能获得表达 ,且表达产物具有抗原活性 ,能与感染患者的血清发生抗原抗体反应。结论　所得到的 MB抗原主蛋白 N端 1 /3保守区片段的基因 ,与 GENE BANK检索序列一致。在大肠杆菌中表达此片段所获得的表达产物 ,有抗原活性 ,有望用于