摘要：通过生物信息学手段分析云南臭蛙抗菌肽的结构与功能,为合成此类抗菌肽和通过基因工程方法生产新药物提供理论依据.通过互联网和计算机软件比较和分析了云南臭蛙抗菌肽的成熟肽序列和二级结构,设计了一个具有抗菌活性的抗菌肽分子.结果表明:成熟肽的正电荷和α螺旋结构与抗菌肽的活性密切相关.根据分析结果,设计了一条抗菌肽序列:GL(A/V/I)AANFLPK(T)AF(L)CXXXK(R)KC,此抗菌肽分子可能具有较强的抗菌活性.表明正电荷是影响抗菌肽与致病菌细胞膜结合的关键,而α螺旋的两亲性结构则在抗菌肽插入脂质双分子层中起重要作用.在维持保守氨基酸不变的情况下,可在适当位置改变或置换一些氨基酸,对天然抗菌肽进行基因改造或人工合成此类抗菌肽,不失为开发新药物的一条捷径.

摘要：鲜味肽是近年来新发现的呈味物质,但国内外对其呈味效果存在争议。导致这一争议的可能原因是验证鲜味肽呈味效果的方法主要是采用化学合成法。为了制备生物源鲜味肽,以便对鲜味肽呈味效果进行再评价,本文以争议性鲜味八肽为目标肽,采用基因工程法,构建了制备生物源鲜味肽的表达载体,并对其表达效果进行了验证。根据争议性鲜味八肽的一级结构Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala和大肠杆菌*** BL21(DE3)的密码子偏爱性,设计了该鲜味八肽的DNA序列,并将其克隆在pET-32a(+)上形成表达载体。通过菌落PCR检测阳性克隆、重组质粒鉴定及工程菌的诱导表达,结果发现,鲜味八肽的目的基因成功重组在pET-32a载体上,所得pET-32a鲜味肽重组载体转化大肠杆菌后能够正常表达融合蛋白。这为后续获得生物源鲜味八肽奠定了基础。

摘要：【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549~790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝(表达单元)pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。

摘要：目的研究siRNA对肝癌耐药细胞系HepG2／mrp1中多药耐药相关蛋白基因（multi—drug-resistant-associated1，mrp1）及其蛋白产物MRP1表达的抑制作用和逆转其耐药性的效果。方法设计合成针对mrp1启动子区域的RNA干扰小片段，转染肝癌耐药细胞HepG2／mrp1。通过RT-PCR和流式细胞仪，在mRNA和蛋白质水平评估RNA干扰对mrp1表达的影响；MTT法检测RNA干扰逆转HepG2／mrp1细胞多药耐药性的变化，按照实验组和亲本组细胞的半数抑制剂量（IC30）评估RNA干扰对细胞耐药倍数的改变。结果在耐药细胞HepG2／mrp1中，RNA干扰明显抑制了mrp1mRNA和蛋白产物MRP1的表达水平，在相同浓度药物作用下实验组细胞耐药性显著下降。结论我们设计的siRNA对肝癌耐药细胞HepG2／mrp1中的mrp1基因有显著的抑制作用，具有良好的逆转多药耐药性的效果。

摘要：目的:筛选靶向人多药耐药相关蛋白基因(mrp1)特异性小分子干扰RNA(siRNA)的有效序列。方法:设计并体外转录合成靶向mrp1的4条siRNA(mrp1-si251,mrp1-si480,mrp1-si795,mrp1-si1016和空白对照si-阴性),转染转基因单因素肝癌多药耐药细胞Hep G2/mrp1。用RT-PCR检测mrp1 mRNA表达,流式细胞仪检测多药耐药相关蛋白表达、细胞内柔红霉素(DNR)蓄积,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞对阿霉素(ADM)的敏感性。结果:4条siRNA均能不同程度逆转Hep G2/mrp1细胞由mrp1介导的多药耐药。转染72h后,mrp1-si795组和mrp1-si1016组的mrp1 mRNA表达水平分别分别下调了(86.36±2.26)%和(85.54±1.04)%,较mrp1-si251组和mrp1-si480组明显下降(P<0.05);细胞内柔红霉素蓄积由多到少依次为mrp1-si795组最多,mrp1-si1016组次之,mrp1-si480组较少,mrp1-si251组最少(P<0.05);mrp1-si795组对ADR耐药的相对逆转率(86.36%)最高,mrp1-si1016组(85.54%)次之,较mrp1-si251组(60.93%)和mrp1-si480组(70.29%)有明显差异(P<0.05);mrp1-si1016组和mrp1-si795组多药耐药相关蛋白表达明显下调。结论:实验设计的靶向mrp1 mRNA的siRNA序列能够不同程度逆转多药耐药相关蛋白介导的人肝癌耐药细胞HepG 2/mrp1的多药耐药性,mrp1-si1016和mrp1-si795效果最好,mrp1-si480较差,mrp1-si251最差。mrp1-si1016和mrp1-si795可以作为进一步实验的靶序列。