摘要：目的利用CRISPR-Cas9技术构建CSF-1R基因敲入小鼠模型。方法将人CSF-1R基因的3到11外显子cDNA的部分序列,加上TGA密码子及WPRE-PolyA原件,插入到了小鼠CSF-1R基因外显子3的第20位丙氨酸下游。在鉴定获得阳性模型后,进一步通过RT-qPCR分析基因的表达特征并进行精子冷冻保种繁殖。结果该基因正确插入设计位点,转录水平显示转入基因能在小鼠模型心脏、肝、脾、肺、肾、脑等脏器中表达,冷冻精子复苏后体外受精的平均受精率达67.74%,平均产仔率16.06%,并经过PCR检测得到阳性小鼠。结论成功构建了人源化CSF-1R基因敲入小鼠模型,为评价肿瘤免疫抗体药效及相关靶向抗肿瘤药物筛选提供了动物模型。

摘要：主要讲述动物实验管理系统的开发背景,设计思路,动物实验管理系统各模块功能介绍以及技术实现。

摘要：以高粱细胞质雄性不育系和保持系 A1Tx6 2 3 A/B,A2 V4 A/B为材料 ,考察了 Mg2 + ,Taq酶 ,d NTP,引物 ,模板等的用量、循环参数及不同的 PCR仪对随机扩增多态性 DNA(RAPD)反应的影响。结果发现 :在 2 5 μL体系中 ,Mg Cl2 2 .0 mmol/L,Taq酶 0 .75 U(1 U=1 μmol/min) ,d NTP0 .1 5mmol/L,引物 1 6 .5 ng,模板 3 0 ng,明胶 0 .0 0 1 % ,KCl5 0 mmol/L,Tris1 0 mmol/L(p H8.3 )为最佳反应混合物组合。对 Peltier Thermal Cycler 2 0 0而言 ,94℃预变性 5 min,94℃变性 1 min,3 5℃退火 1 min,72℃延伸 2 min,最后 72℃保温 5 min,共计 40个循环为最佳扩增条件 ;对 Perkin ElmerCetus DNA Thermal Cycler- 480而言 ,采用 94℃预变性 3 min后 ,前 3个循环 ,94℃变性 1 min,3 5℃退火 1 min,72℃延伸 2 min,后 3 7个循环 ,94℃变性 3 0 s,3 6℃退火 45 s,72℃延伸 1 min,最后72℃保温 5 min的循环程序可获得理想扩增。并阐述了优化 RAPD实验体系的设计原则。

摘要：目的通过增强血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)人源化小鼠(hKDR^(+/+))接纳不同来源的小鼠肿瘤细胞系的潜力,建立能支持多种肿瘤细胞系成瘤的、可评价针对VEGFR靶点药物的新型荷瘤小鼠模型。方法首先建立基于hKDR^(+/+)人源化小鼠模型评价针对VEGFR靶点抗体体内活性的方法,同时采用CRISPR/Cas9技术构建重组激活基因1(recombination activating gene 1,Rag1)敲除的C57BL/6N小鼠(命名为Rag1^(-/-)小鼠)。然后将Rag1^(-/-)小鼠与hKDR^(+/+)小鼠交配,筛选获得双基因纯合、双靶点基因修饰的hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)小鼠。最后在hKDR^(+/+)、Rag1^(-/-)、hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)和C57BL/6N小鼠上测试不同小鼠品系来源肿瘤细胞系的体内肿瘤生长差异。结果针对VEGFR靶点设计的抗体在hKDR^(+/+)小鼠体内表现出明显的抗肿瘤活性,与PBS组相比,肿瘤体积明显减小(P<0.01),肿瘤质量明显减轻(P<0.05)。Rag1^(-/-)小鼠、hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)小鼠的外周血B细胞和T细胞数量均明显减少(P<0.05,P<0.001)。C57BL/6小鼠来源的MC38细胞接种7 d后,在hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)、Rag1^(-/-)、C57BL/6N和hKDR^(+/+)四组小鼠体内均可见肿瘤生长。BALB/c小鼠来源的CT26细胞接种10 d后,仅在hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)和Rag1^(-/-)小鼠体内见到肿瘤生长,在C57BL/6N及hKDR^(+/+)小鼠中均未见肿瘤生长;接种后3周,hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)小鼠的成瘤体积明显大于Rag1^(-/-)小鼠(P<0.01)。结论获得了Rag1基因敲除小鼠,并进一步筛选获得新型hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)双靶点基因修饰小鼠模型;Rag1基因缺失时,不同品系小鼠来源的肿瘤细胞系更易成瘤。这提示可以通过降低hKDR^(+/+)人源化小鼠的免疫反应能力,增强或扩大该模型小鼠接纳肿瘤细胞系的范围,构建多种可用于评价VEGFR靶点药物的荷瘤小鼠模型。

摘要：目的使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除长度约为90kb的小鼠FcγR2b,FcγR3,FcγR4基因簇,为构建FcγR基因人源化小鼠奠定基础。方法使用在线预测软件在FcγR2b,FcγR3外显子区设计sgRNA,在每一位点挑选脱靶效应较低的五个候选sgRNA。通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒检测sgRNA在体外的活性。选取活性较高的sgRNA体外转录,与Cas9mRNA一并注射受精卵。通过PCR检测及测序,得到1只敲除片段为89711bp的基因修饰小鼠,且同时敲除FcγR2b基因5’端,FcγR3基因3’端及FcγR4基因。而且还利用软件预测了8个脱靶可能性最高的位点,并对首建鼠基因组的上述8个脱靶位点全部测序确认。结果结果显示未在预测脱靶位点附近发现小片段插入或缺失。结论建立了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组超大片段的技术,该技术结合BAC转基因技术,将为建立含有复杂基因族的人源化小鼠提供新的途径。

摘要：目的:通过尿烷多次给药初步验证自主建立的P53^(+/-)基因敲除小鼠(B6-Trp^(tm1)/NIFDC)模型是否比野生型C57BL/6小鼠对尿烷敏感,为国内用于药物临床前安全评价致癌实验短期体内试验提供可用的基因修饰动物模型。方法:在C57BL/6来源的ES细胞中,通过打靶技术敲除p53基因的第2~5外显子后对获得的P53^(+/-)基因敲除小鼠进行PCR基因型鉴定,再与普通C57BL/6小鼠杂交,获得的后代再通过PCR筛选获得基因敲除动物(命名为B6-Trp^(tm1)/NIFDC)。尿烷验证试验共设计3个组,阴性对照组(野生型小鼠):给予生理盐水,尿烷组1(P53^(+/-)敲除小鼠):给予尿烷,尿烷组2(野生型小鼠):给予尿烷,给药方式为腹腔注射共给药3次,给药剂量为1 000 mg·kg^(-1)。给药后第8周开始肿瘤触诊观察,每周1次。给药后6个月后进行计划剖解,通过大体剖检和组织病理学检查以评价P53^(+/-)敲除小鼠对尿烷致癌作用的敏感性。结果:成功获得杂合的P53^(+/-)基因敲除小鼠,给予尿烷后可诱发P53^(+/-)敲除小鼠发生肝脏血管扩张、肺腺瘤、颌下腺血管瘤及脾脏淋巴瘤,病变发生率分别为94.4%、33.3%、5.6%、5.6%;野生型小鼠肝脏血管扩张及肺脏腺瘤的发生率分别为36.8%、10.5%;阴性对照组无肿瘤发生。结论:本研究初步验证自主建立的P53^(+/-)基因敲除小鼠对尿烷的致癌敏感性高于野生型小鼠,该模型有望将来是临床前药物安全性评价致癌性实验短期体内试验候选模型之一。

摘要：目的设计并验证能够高效切割Hipp11位点的sgRNA,为在Hipp11位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11位点的sgRNA进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒在体外检测sgRNA的活性。选取活性较高的sgRNA体外转录,与Cas9 m RNA一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11位点切割效率,计算出sgRNA的体内活性。结果两个sgRNA的体外活性分别为19.2%和51.7%,使用体外活性高的2号sgRNA显微注射获得8只新生小鼠,其中62.5%(5/8)的小鼠中检测到Hipp11位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR技术在Hipp11位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA体外活性能够预测sgRNA在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA的有效手段。

摘要：使用TALEN技术制作p53基因敲除大鼠模型,建立种群并分析大鼠表型。设计特异性识别p53基因外显子2的TALEN蛋白并构建相应载体,将体外转录的TALEN m RNA注射SD大鼠受精卵,出生后从仔鼠中通过测序筛选靶位点正确剪切的阳性小鼠。结果显示,注射得到11只新生仔鼠,通过测序发现其中有10只靶位点发生剪切。选取其中4只作为首建鼠进行繁殖。p53基因敲除纯合子表现出肿瘤易发性,主要自发性肿瘤类型为恶性纤维组织肉瘤。此外,p53基因敲除纯合子大鼠表现出眼睛发育异常,视网膜变性及晶状体纤维排列紊乱。通过TALEN技术高效地获得了p53基因敲除大鼠模型,纯合子敲除大鼠除了易发肿瘤并伴有眼发育异常,因而该敲除大鼠模型除了可用于研究肿瘤发生机制外,也可用于研究p53基因在眼发育过程中的功能。

摘要：目的:观察自主建立的p53^(+/-)敲除小鼠(命名为B6-Trp53tm1/NIFDC)模型,在给予尿烷后的体重、脏器重量、血液学及血生化指标变化,为该模型将来用于临床前药物短期致癌性试验的替代试验提供背景数据。方法:共设计3个组:阴性对照组(野生型小鼠,给予生理盐水)、尿烷组1(B6-Trp53tm1/NIFDC小鼠,给予1000 mg·kg^(-1)尿烷)、尿烷组2(野生型小鼠,给予1000 mg·kg^(-1)尿烷),各组动物数量均为20只,雌雄各半。试验期间及试验结束测定各组动物的体重、脏器重量和相对脏器重量、血液学及血生化指标,并进行统计分析。结果与结论:与阴性对照组相比,尿烷给药第2、3、11及21周尿烷组1和尿烷组2动物的体重显著下降;尿烷组1动物肺脏和脾脏绝对重量显著升高;尿烷组1和尿烷组2动物肺脏相对重量显著升高;尿烷组1动物NEU、RDW%、CHDW%以及尿烷组2动物LYM%、BASO%显著升高;尿烷组1及尿烷组2动物的血生化指标无明显改变。

摘要：目的测定自主建立的p53+/-基因敲除小鼠(B6-Trp53^(tm1)/NIFDC)在N-甲基-N-亚硝基脲(N-Methyl-Nnitrosourea,MNU)给药后体质量、脏器质量、血液学及血生化指标,为临床前药物安全评价致癌性实验短期体内替代试验候选遗传修饰动物模型提供背景性数据。方法共设计4个组:阴性对照组(野生型小鼠)给予生理盐水、溶媒对照组(B6-Trp53^(tm1)/NIFDC小鼠)给予枸橼酸缓冲液、MNU组1(B6-Trp53^(tm1)/NIFDC小鼠)给予75 mg/kg MNU、MNU组2(野生型小鼠)给予75 mg/kg MNU,阴性对照组和MNU组2每组野生型小鼠各20只,雌雄各半,溶媒对照组和MNU组1每组B6-Trp53^(tm1)/NIFDC小鼠各20只,雌雄各半,测定其体质量、主要脏器质量、相对脏器质量、血液学及血生化指标,并进行统计分析。结果 MNU组1、MNU组2动物体质量降低与阴性对照组、溶媒对照组相比都存在显著性统计学差异(P<0.05)。MNU组1、MNU组2动物心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胸腺和颌下腺的绝对质量与阴性对照组、溶媒对照组相比有显著性统计学差异(P<0.05)。MNU组1和MNU组2动物心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺和颌下腺的相对质量与阴性对照组、溶媒对照组相比有显著性统计学差异(P<0.05)。MNU组1和MNU组2动物均发现NEU、LYM%、LUC%、RBC、HGB、HCT、MCV、MCHC、RDW、HDW、CHCM、CHDW、PDW、MPV及PLT等15个指标与阴性对照组和溶媒对照组相比有显著性统计学差异(P<0.05)。另外,MNU组1和MNU组2均发现TP、ALB、CREA、UREA、TCHO、TG、CA等7个指标与阴性对照组和溶媒对照组有显著性统计学差异(P<0.05),MNU组2的AST与阴性对照组和溶媒对照组有显著性升高(P<0.05),但MNU组1和MNU组2组间没有显著性统计学差异。结论本文测定并分析了自主建立的p53+/-基因敲除小鼠(B6-Trp53^(tm1)/NIFDC)和野生型小鼠分别给予MNU及枸橼酸缓冲液后的体质量、脏器质量、血液学及血生化指标,该模型有望将来用于临床前药物安全评价致癌性实验短期体内替代试验。