摘要：构建表达Tir和Hly的融合基因,将Tir基因的C端414个氨基酸残基(Tir414)基因部分与Hly基因的C端300个氨基酸残基(Hly300)基因部分串联构建pET28a-Tir414-Hly300重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达。薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。由于该融合蛋白由Tir和Hly2部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和溶血素(Hly)的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。

摘要：设计32对PCR引物分片段扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）江苏分离株JS2012全基因组,扩增产物克隆到p MD19-T载体并测序。用DNAstar软件将JS2012全基因组序列与Gen Bank中其他13株TGEV株和猪呼吸道冠状病毒（PRCV-ISU-1）序列进行比对以及同源性分析,并绘制基因进化树。JS2012基因组序列全长28 542 bp,不包括poly A。基因组的排列为TGEV典型的基因排列序：5＇-ORF1a-ORF1b-S-3a-3b-E-M-N-7-3＇。TGEV JS2012株的ORF3基因和Miller组病毒一样有2个大片段的缺失。JS2012的S基因和Miller M6以及Virulent Purdue 2个强毒株有同样的序列特征。除Virulent Purdue外,其余Purdue株在1 123~1 128 bp处均有6 bp的缺失,JS2012与所有Miller株及Virulent Purdue一样,此处没有缺失。JS2012与其他TGEV毒株之间的碱基序列同源性为98.6%-99.9%,与Miller M6的碱基序列同源性最高,亲缘关系最近,同属于Miller组,与Purdue组相对较远。

摘要：选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqm an探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV。利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80。pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线。以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测。该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数。PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出。用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒。建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测。

摘要：根据GenBank中的猪抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了PKR、OAS/RNase L及Mx的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx标准曲线及其直线回归方程;该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点;建立的荧光定量PCR方法可检测抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx mRNA水平。为猪体内抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx的mRNA水平的定量检测提供必要的技术。

摘要：[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和Taq Man探针,构建分别包含PCV2 ORF1和ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于PCV2 ORF1和ORF2的Taq Man荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101copies/μl,ORF2方法可达1.0×102copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。

摘要：猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为46 kDa的融合蛋白,蛋白表达量较高,而且蛋白以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western Blot结果显示,表达的NP1蛋白能与His抗体发生特异性的免疫反应,表明原核表达的NP1蛋白具有良好的反应原性。

摘要：参照GenBank上已发表的次黄嘌呤核甘酸脱氢酶（IMPDH）基因序列，设计引物，对34个猪链球菌不同血清型（缺12型）国际标准株进行了IMPDH基因的PCR检测及序列分析。结果表明：除17型、24型、32型、33型和34型外，其他29个血清型都为阳性，其核苷酸序列的同源性为88．3％～100．0％，所推导的蛋白质序列的同源性为94．7％～100．0％。为进一步研究IMPDH的生物学特性和功能奠定了基础。

摘要：为了建立定量检测猪链球菌2型(SS2)粘附相关因子mRNA转录水平的荧光定量PCR方法,根据已报导的SS2粘附相关因子甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、分选酶A(SrtA)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGD)及其管家基因aroA,用GenBank登录的核苷酸序列,设计特异性引物,提取SS2总RNA,经RT-PCR扩增和克隆了各粘附相关因子的核苷酸片段,以构建含有各自引物扩增序列的重组质粒,建立检测各粘附相关因子SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法起始模板数的对数与荧光信号达到所设定荧光阈值所经历的循环数(Ct)之间线性关系好,相关系数均达到0.995以上;扩增产物形成单一的特异性熔解峰;初始模板的检出下限达到了1μl 1.0×102拷贝数;组内变异系数小于2%,说明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。

摘要：为了更好防治由出血性大肠杆菌O157:H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗具有很大优势。方法:构建表达tir和stxb的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stxB亚基基因72个氨基酸串联,构建pET28a-stx2b-Tir295-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达。结果:薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。结论:由于该融合蛋白由Tir、stx1b和stx2b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(stx)的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。

摘要：为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA。二免后攻击50LD50的EHECO157∶H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短。结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。