摘要：目的 ALKBH2基因高表达于尿路上皮肿瘤,RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术难以稳定均一性的下调靶基因。文中旨在构建人源ABH2基因shRNA干扰慢病毒表达载体并进行鉴定。方法选取ABH2基因,分析该基因的编码区序列,进行单链oligo的设计及合成,利用PCR对合成的oligo进行拼接反应,将合成好的序列装入pcDNA3.1(+)载体并转化至感受态细胞DH5α,测序鉴定重组克隆中基因序列后构建表达载体pcDNA3.1(+)/ABH2。根据不同的载体分为4组:siRNA-468组、siRNA-571组、siRNA-662组和对照组。根据靶基因序列设计并合成3对shRNA,构建入U6载体。将shRNA载体分别与表达载体共转染入HEK293细胞,通过QPCR检测筛选出最优干扰序列。将筛选到最有效的shRNA-571干扰序列构建入慢病毒载体pL/shRNA/F载体,用构建的慢病毒干扰载体和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度。将LV-shRNA-571与过表达载体pcDNA3.1(+)/ABH2共转染肾癌细胞株ACHN,通过QPCR鉴定干扰效果。结果克隆测序验证无误,慢病毒载体构建成功。转染实验48 h后,收集293细胞分泌的病毒上清测定病毒的滴度为1.1×108TU/mL。对照组ABH2 mRNA相对表达量为0.785±0.082,siRNA-571组为0.078±0.006,RNAi后ABH2基因的mRNA表达水平(0.078±0.006)与对照组(0.785±0.082)相比显著降低(P<0.01),慢病毒PL/shRNA/F-ALKBH2-571对目的基因ABH2的干扰效率为92.2%。结论成功构建ABH2基因RNAi慢病毒载体并得到鉴定。

摘要：目的 观察基因芯片分析联合小型干扰（siRNA）人端粒酶RNA（hTR）及人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的影响.方法 根据siRNA设计原则和TERT、TR基因mRNA编码序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA序列并筛选出最高效抑制序列（pRNAT-TERT-Ⅲ：GTACAGGTTTCACGCATGT基因的第3229位、pRNAT-TR-Ⅲ：CGAAGGTGCCTTGGAATAT基因的第306位）.构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰（RNAi）装置pRNAT-TR-Ⅲ＋pRNAT-TERT-Ⅲ（脂质体法）并将其转染膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株,采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）分析hTR和hTERT mRNA表达（以目的基因与GAPDH拷贝数比值进行相对定量分析）,端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验（TRAP-ELISA）检测端粒酶活性（测其A值）,噻唑蓝（MTT）比色法检测BIU-87细胞的生长抑制（按MTT法检测转染细胞的存活率）,并对联合RNAi前后进行基因芯片分析,采用RNA抽提、RNA质量检测、cRNA标记与合成、芯片杂交、化学发光检测、图像采集和数据分析,并进一步采用逆转录（RT）-PCR验证部分差异表达基因.结果 联合RNA干扰hTR及hTERT基因后,pRNAT-TERT-Ⅲ＋pRNAT-TR-Ⅲ的联合RNAi可以特异性抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株中TERT和TR表达（pRNAT-TERT-Ⅲ＋pRNAT-TR-ⅢTERT：0.300±0.033,P＜0.05;TR：0.430±0.028,P＜0.05）.且联合RNAi后膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长和端粒酶活性均明显受到抑制（pRNAT-TERT-Ⅲ＋pRNAT-TR-Ⅲ：1.250±0.012,P＜0.05）.联合siRNA前后进行基因芯片分析发现21个基因下调（ATM、BAX、BCL2、BCL2L1、BIRC5、CD44、CTNNB1、E2F1、JUN、MCAM、MTA1、MYC、NFKB1、NFKBIA、NME4、PNN、PRKDC、SERPINE1、THBS1、TNFRSF1A、UCC1）.结论 联合RNA干扰hTERT及hTR基因能明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长;联合siRNA抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长的原因为21个基因下调所致.

摘要：目的探索联合RNA干扰TR及TERT[小型干扰RNA（siRNA）、人端粒酶RNA（hTR）及人端粒酶逆转录酶（hTERT）]基因对膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87端粒酶活性及其增殖的影响。方法根据hTRmRNA和hTERTmRNA的序列，分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA并筛选出最高效抑制序列（pRNAT—TR—Ⅲ、pRNAT-TERT-Ⅲ），构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰装置***—Ⅲ、pRNAT—TERT—Ⅲ（脂质体法）并将其转染BIU-87细胞株，采用荧光定量PCR分析hTR及hTERTmRNA表达，TRAP-ELISA检测端粒酶活性，MTT法检测细胞增殖。结果分别及联合RNA干扰hTR及hTERT基因后，pRNAT—TERT—Ⅲ，pRNAT—TR-Ⅲ及pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR-Ⅲ的联合干扰可以特异性抑制BIU-87细胞株中TERT和TR表达（分别减少pRNAT—TERT-ⅢTERTmRNA：67％、pRNAT—TR-ⅢTRmRNA：41％、pRNAT—TERT—Ⅲ、pRNAT—TR—ⅢTRmRNA：57％、pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR—Ⅲ TERTmRNA：70％，P〈0．05）。且膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87的生长和端粒酶活性均明显受到抑制，以联合RNA干扰尤为明显（pRNAT—TERT-Ⅲ：1．80±0．014，pRNAT—TR—Ⅲ：1．95±0．016，pRNAT—TERT-Ⅲ、pRNAT—TR-Ⅲ：1．25±0．012，P〈0．05）。结论联合RNA干扰hTERT及hTR基因能更明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长，为其临床应用奠定了基础。

摘要：目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。

摘要：目的 :通过以阿莫西林钠 克拉维酸钾 (安灭菌 )为对照药进行临床研究 ,评价阿莫西林钠 舒巴坦钠治疗常见致病菌引起的细菌感染性疾病的临床疗效和安全性。　方法 :采用随机对照盲法平行试验设计 ,入选病例 4 8例 ,脱落 1例 ,完成 4 7例。其中呼吸道感染 2 3例 ,泌尿系统感染 2 4例。试验组 (2 4例 )应用注射用阿莫西林钠 舒巴坦钠 1.5g/次 ,每 12h或 8h一次静滴 ;对照组 (2 3例 )应用安灭菌 1.2 g/次 ,每 12h或 8h一次静滴。疗程均为7～ 14天。　结果 :阿莫西林钠 舒巴坦钠治疗呼吸道感染、泌尿系统感染的痊愈率和有效率分别为 91.6 6 %和10 0 %、83.33%和 91.6 7% ,总痊愈率和有效率为 87.5 0 %和 95 .83% ,与安灭菌对照组比较无显著差异。阿莫西林钠 舒巴坦钠对分离细菌的清除率为 10 0 %。应用注射用阿莫西林钠 舒巴坦钠未见严重不良反应 ,仅发生皮疹 1例、恶心 3例 ,总发生率为 16 .6 7% (4 / 2 4 ) ,与安灭菌对照组比较无显著差异。　结论 :四类新药阿莫西林钠 舒巴坦钠对临床常见致病菌引起的呼吸道、泌尿系统感染 ,尤其是产酶菌引起的严重感染 ,临床疗效较好 ,使用安全 。