摘要：RNA干涉(RNA interference,RNAi)是指序列特异性的转录后基因沉默,它已经发展成为高效、特异阻断目的基因表达的有效工具。据此,我们针对人VEGF_(165)基因mRNA序列,设计了2个干涉靶位点,体外转录合成siRNA,通过脂质体转染入HeLa细胞,分别体内、体外观察对HeLa细胞凋亡的影响。

摘要：目的:探讨利用干扰RNA(RNAi)抑制血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法:设计针对VEGF基因的小干扰RNA(siRNA),合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGFmRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果:所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论:体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。

摘要：为探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)对树突状细胞(dendritic cell,DC)功能及其分化的影响,针对VEGF基因设计siRNA(small interferingRNA,siRNA),采用脂质体转染法以100nmol/L最佳转染浓度导入MCF-7乳腺癌细胞(siRNA组),以脂质体Lipofectamine2000TM转染MCF-7乳腺癌细胞培养上清培养正常DC作为对照(对照组),采用ELISA法检测经siRNA干扰VEGF基因后的MCF-7乳腺癌细胞分泌的VEGF因子含量,Western印迹检测VEGF蛋白表达,以探讨siRNA的基因沉默效果;以siRNA组和对照组培养上清分别培养外周血单个核细胞,用流式细胞仪检测所诱导DC表型CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,用MTT法检测转染前后两组DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)对MCF-7细胞的细胞毒作用.结果显示,MCF-7乳腺癌细胞培养上清能明显抑制正常DC分化成熟及抗原递呈能力,干扰VEGF基因后MCF-7乳腺癌细胞培养上清对DC的影响明显降低,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达较对照组显著升高,而CD1a表达下降(P<0.01).转染前后DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤活性有明显差异(P<0.01).由此可见,siRNA可靶向抑制MCF-7乳腺癌细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7细胞上清对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低,从而推测VEGF在肿瘤的发生、发展和免疫抑制方面可能起着重要的作用.

摘要：目的研究连接适配体的DNA-RNA分子作为杂交载体靶向肿瘤细胞并导入功能性RNA分子进入细胞的有效性,以及对肿瘤细胞的影响。方法设计合成短的互补DNA、RNA分子,组装成DNA-RNA杂合链;连接AS1411适配体为靶向分子,再分别连接p21 saRNA和TIGIT siRNA作为药物分子,记为P21 saRNA和TIGIT siRNA,构成杂交载体,通用结构式为AS1411-DNA/RNA-sxRNA;检测AS1411-DNA/RNA-sxRNA能否靶向结合并进入肿瘤细胞及其对瘤细胞生存、迁移、侵袭和凋亡的影响。结果将设计的杂交载体各部分等摩尔加入杂交缓冲体系并于特定温度条件下孵育,TBM聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到AS1411-DNA/RNA-sxRNA成功组装;AS1411-DNA/RNA-sxRNA杂交载体在10%血清条件下也显示出良好的抗降解稳定性;荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察,SKOV3细胞表面及胞内存在绿色大量荧光信号,杂交载体成功进入肿瘤细胞。杂交载体孵育后:在mRNA水平上,p21基因表达(2.14±0.25)是对照组(1.02±0.10)2倍以上,P<0.05;TIGIT基因表达(0.63±0.09)低于对照组(1.09±0.15),P<0.05;在蛋白质水平上,p21基因表达(1.57±0.16)是对照组(1.10±0.09)1.5倍以上,P<0.05;TIGIT基因表达(0.61±0.12)低于对照组(1.01±0.07),P<0.05。CCK-8实验显示,P21saRNA(3.10±0.13)和TIGIT siRNA(2.91±0.13)杂交载体孵育组与空白对照组(3.67±0.15)相比,卵巢癌细胞增殖能力显著下降(P<0.05);划痕实验结果显示,P21 saRNA孵育组愈合率(42.53±2.90)%、TIGIT siRNA孵育组愈合率(36.23±3.43)%,明显低于空白对照组(76.47±3.64)%,P<0.05;Transwell检测迁移能力发现:P21 saRNA孵育组(128.25±5.36)、TIGITsiRNA孵育组(119.50±8.79)低于对照组(186.5±8.56);侵袭能力:P21saRNA孵育组(145.5±9.45)、TIGITsiRNA孵育组(112.25±5.63)也显著低于对照组(202.50±10.12),P<0.05;细胞凋亡率:P21saRNA孵育组(11.74%±2.47%)、TIGIT siRNA孵育组(17.12%±2.04%)明显高于对照组(5.66%±1.44%),P<0.05。结论所制备的AS1411-DNA/RNA-sxRNA杂交载体能够有效靶向肿瘤细胞,携带功能性小RNA靶向导入肿瘤细胞并调控目的基因表达,使肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力受到抑制;该结果为利用DNA-RNA偶联AS1411适配体作为靶向工具的杂交载体,靶向杀伤表面表达NCL蛋白的肿瘤细胞提供了实验基础。

摘要：目的应用经过化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体外抑制血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因的表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰技术对乳癌基因治疗的可行性和特异性。方法设计针对VEGF-C基因的siRNA,选用阳离子脂质体LipofectamineTM2000作为转染试剂,以脂质体转染法将双链siRNA导入人乳癌细胞株MCF-7细胞,设立空白对照组(只加无血清无抗生素培养基)、脂质体组(每孔只加Lipofectami-neTM20000.5μL)、3个siRNA浓度梯度组(50、100、200nmol/L)及siRNASCR组(100nmol/L),用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响,通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot分别检测转染前后VEGF-C基因和p53基因的mRNA及蛋白表达变化。结果转染VEGF-CsiRNA48h后MCF-7细胞生长受到抑制,Hoechst33258荧光染色显示转染siRNA72h后细胞内可见凋亡小体。VEGF-C基因和p53基因mRNA和蛋白水平表达明显降低(F=30.74～114.11,q=5.74～20.75,P0.05)。结论化学修饰的siRNA介导的RNA干扰能下调靶基因VEGF-C的表达和抑制MCF-7细胞增殖,乳癌中p53与VEGF-C表达有关,提示突变型p53可能参与VEGF-C表达的调控。

摘要：目的筛选、研究小激活RNA(small activating RNA,saRNA)增强ABCG2基因表达对肾、肠细胞排泄尿酸(uric acid,UA)的影响,探索促进UA排泄的全新一类治疗机制药物。方法设计靶向小鼠和人ABCG2基因的saRNA,转染小鼠肾小管上皮细胞(TCMK-1)和人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western Blot筛选强激活效果的saRNA;检测强激活saRNA增强TCMK-1和HK-2细胞排泄UA的作用。筛选的saRNA通过尾静脉注射高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)模型小鼠,检测血尿酸(serum uric acid,SUA)、尿尿酸(urine uric acid,UUA)、肠道UA、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,SCr)含量,以及肝脏黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)活性,验证所选saRNA促进UA排泄的作用。苏木精-伊红染色法(H&E)染色观察小鼠肾脏和小肠病理改变。RT-qPCR,Western blot和免疫组化分析肾脏和小肠ABCG2基因表达水平。结果筛选到小鼠和人ABCG2 saRNA各2条,分别命名为saRNA-1/2和hsaRNA-1/2,能够提高TCMK-1和HK-2细胞ABCG2基因的表达(P0.05)。结论所筛选的saRNA能够提高ABCG2基因的表达,并促进细胞内和小鼠体内UA的排泄,降低SUA水平。

摘要：背景:硫酸软骨素是细胞基质的重要成分,可促进肿瘤细胞的增殖,抑制其转移。目的:观察硫酸软骨素对阿霉素作用下HL60细胞增殖分化的影响。设计:开放性实验。单位:青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室。材料:实验于2003-09/2004-12在青岛大学医学院生物化学与分子生物学研究室完成。HL60细胞株购于中国医学科学院上海细胞库,为人类早幼粒白血病细胞。牛软骨硫酸软骨素(Sigma)。方法:①细胞传代培养后将进入对数增殖期的细胞用含体积分数0.1灭活胎牛血清的RPMI1640培养液配制成1×108L-1的细胞悬液,分装于45个培养瓶中,4mL/瓶。②取分装好的细胞悬液15瓶,按照0,5,25,50,75mg/L浓度加入硫酸软骨素,每个浓度平行3瓶,空白对照组加入等量的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。采取细胞计数法测定硫酸软骨素处理后的HL60细胞密度的变化。③取分装好的细胞悬液30瓶,分为硫酸软骨素+阿霉素组、硫酸软骨素组,各15瓶。按照0,5,25,50,75mg/L浓度向两组加入硫酸软骨素,每个浓度平行3瓶,空白对照组加入等量的0.01mmol/L磷酸盐缓冲液。用MTT法测定硫酸软骨素处理后的HL60细胞加入阿霉素后细胞存活率的变化。④取分装好的细胞悬液15瓶,按照0,5,25,50,75mg/L浓度加入硫酸软骨素,每个浓度平行3瓶,空白对照组加入等量的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。用酶联免疫反应测定各组细胞的酸性磷酸酶活性,观察其对细胞分化的影响。主要观察指标:①硫酸软骨素对HL60细胞增殖的影响。②硫酸软骨素+阿霉素对HL60细胞存活率的影响。③硫酸软骨素对HL60细胞酸性磷酸酶活性的影响。结果:共制备细胞悬液45瓶,全部进入结果分析。①与空白对照组比较,不同浓度硫酸软骨素处理24h后HL60细胞密度均显著升高(P0.05),说明在这个浓度范围内硫酸软骨素对细胞生长的促进作用变化不大。②与空白对照组比较,加入不同浓度硫酸软骨素后,硫酸软骨素+阿霉素组细胞存活率均有不同程度的降低,硫酸软骨素浓度超过25mg/L时降低明显(P<0.01)。③与空白对照组比较,5,25,50mg/L硫酸软骨素浓度组HL60细胞酸性磷酸酶吸光度值均明显升高(1.268±0.038,1.305±0.101,1.321±0.021,1.354±0.013,P<0.01或0.05),尤其是75mg/L硫酸软骨素浓度组HL60细胞酸性磷酸酶吸光度值高达1.406±0.113,与空白对照组比较差异有极显著意义(P<0.001)。结论:硫酸软骨素在适当浓度时对HL60细胞的增殖产生促进作用,可提高HL60细胞对阿霉素的敏感性,促进细胞分化。

摘要：目的研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的影响。方法利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VEGF mRNA的siRNA,通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC-7901细胞,设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照,用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化,ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化。结果所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长,并使细胞周期阻滞于G0/G1期;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制,明显减少;同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低,作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化。结论体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901细胞VEGF基因的表达。

摘要：目的:研究siRNA(small interfering RNA)对人胃腺癌细胞SGC-7901的VEGF基因表达的影响．方法:选择血管内皮生长因子(VEGF)基因为靶基因,设计两组针对VEGF mRNA的小干扰RNA,合成DNA寡核苷酸链,体外转录合成siRNA．以人胃腺癌细胞系SGC-7901为靶细胞,应用脂质体转染的方法,将siRNA导入细胞．采用Hoechst33258染色观察siRNA作用于SGC-7901细胞中出现凋亡小体的情况．流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT-PCR法比较转染前后VEGF mRNA表达水平的变化, ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化．结果:两组siRNA转染后均能有效地抑制 SGC-7901细胞的生长,诱导细胞凋亡产生凋亡小体．siRNA作用于SGC-7901细胞．其细胞周期均发生了明显的变化,主要表现为G0／G1 期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0／G1期(siRNA1组,siRNA2组G0／G1期VS 对照组G0／G1期:75．04％,76．52％ vs 58．37％, P<0．01;siRNA1组,siRNA2组S期vs对照组S 期:17．82％,16．73％ vs 39．52％,P<0．01),而其他组则无明显变化．VEGF mRNA的表达量大幅度减少(siRNA1组,siRNA2组vs对照组: 0．638±0．078,0．656±0．085 vs 0．941±0．046, P<0．01),相对应的VEGF蛋白水平也显著降低(164．7±22．7,166．3±26．6 vs 414．0±61．5, P<0．01),而其他组siRNA转染后则无上述作用．结论:应用靶向VEGF基因RNA干扰技术可以有效抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖．

摘要：目的:利用siRNA(small interference RNA)技术研究c-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法:依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对c-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet- SITM-ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA-scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT-PCR法比较转染前后c-myc mRNA表达水平的变化。结果:细胞计数法结果显示,转染24 h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48 h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论:体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。