摘要：目的构建针对人MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对食管癌细胞MTA1基因表达的抑制作用。方法设计MTA1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR和Westernblotting分别检测MTA1基因mRNA和蛋白表达的变化。结果把针对MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Westernblotting检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低,其中以481-499(GACCCTGCTGGCAGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最强,MTA1蛋白几乎完全不表达。结论成功构建出沉默食管癌细胞MTA1基因表达的siRNA载体,为通过沉默MTA1基因的表达来减少恶性肿瘤侵袭转移提供了实验基础。

摘要：目的利用RNA干扰(RNAi)技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建特异性的RNA干扰真核细胞表达载体。方法根据GenBank提供的人TF基因的核苷酸序列,设计具有小发夹结构的2条DNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至干扰载体pSUPER质粒中,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,最后进行DNA测序。结果构建成功的针对人TF基因的RNA干扰真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计序列完全一致。结论成功构建了针对人TF基因的真核载体,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新方法。

摘要：背景：骨髓间充质干细胞联合造血干细胞移植是最有希望解决造血重建缓慢的策略之一，但临床实施中，抽取骨髓进而分离、扩增间充质干细胞尚不能为大部分健康供者所接受。目的：探讨小鼠脂肪源间充质干细胞对异基因重型再生障碍性贫血模型鼠造血功能的影响。设计、时间及地点：细胞学体内实验，于2007—05／11在河南省肿瘤医院中心实验室完成。材料：雄性6～8周龄BALB／c（H-2K^d）小鼠20只，雌性7～8周龄C57BL／6（H-2K^b）小鼠50只，均购于河南省实验动物中心。方法：贴壁法体外分离培养20只雄性BALB／c小鼠脂肪源间充质干细胞；反复吹打20只雌性C57BL／6（H-2K^b）小鼠骨髓细胞，加入EDTA-NH4Cl液去除红细胞，即为骨髓有核细胞。剩余30只雌性C57BL／6（H-2K^b）小鼠均给予一次全身3．0Gy^60Co-γ照射，照射后第4，5，6天皮下注射环磷酰胺及氯霉素，建立重型再生障碍性贫血模型。模型鼠随机分为3组，联合组经尾静脉输入骨髓有核细胞2×10^9个＋脂肪源间充质干细胞3×10^6个，骨髓有核细胞组单纯输入骨髓有核细胞2×10^7个，对照组输入生理盐水0．2mL，10只/组。主要观察指标：定期检测外周血和股骨有核细胞数以及巨噬细胞／粒细胞集落形成单位数的变化，PCR法鉴定Y染色体，流式细胞仪检测移植小鼠骨髓及脾脏CD3和H-2K^d阳性表达情况。结果：细胞移植后第2周，联合组外周血有核细胞数、股骨有核细胞数、巨噬细胞／粒细胞集落形成单位数均明显高于骨髓有核细胞组（P〈0．05），且随移植时间的延长，各种细胞数量逐渐恢复（P〈0．05）。细胞移植后第4周（即造血恢复期），联合组外周血可特异性地扩增Y染色体的SRY基因片段，移植小鼠骨髓及脾脏中CD3和H-2K^d双阳性细胞达6．66％，提示在受体小鼠体内有供体细胞的存在。结论：脂肪源间充质干细胞能够重建重型再生障碍性贫血小鼠的造血功能，促进小鼠造血系统的恢复。

摘要：目的研究胃癌组织中野生型和突变型DNA聚合酶β在DNA修复过程中的作用,为进一步探讨肿瘤的病因发病学奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,以野生型和突变型DNA聚合酶β基因为模板,扩增后构建pGEM-T-polβ克隆载体,经PCR筛选,亚克隆于pET28a(+)表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌,经诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。设计3条单链DNA引物,退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化蛋白共做碱基切除修复(BER)实验,最后琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果成功构建了pET28a(+-)polβ重组表达载体;在BER实验中,野生型DNA聚合酶β能够在DNA底物的酶切位点处将其切开,突变型DNA聚合酶β不能或部分将其切开。结论野生型DNA聚合酶β能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型DNA聚合酶β在碱基缺失修复过程中的作用丧失或减弱。

摘要：病理生理学实验教学与临床结合有利于培养学生的动手能力和临床思维能力,加深对疾病发生机制的理解。病理生理实验教学通过开展实验设计、巧妙设立问题、典型病例分析与临床结合,激发学生兴趣,为临床教学打下基础。

摘要：目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.

摘要：目的:构建DNA聚合酶β(polβ)靶向的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体。方法:根据GenBank中人DNApolβ基因(M13140)的全长序列,利用设计分析软件设计2个DNApolβ靶向发卡样siRNA结构,退火后形成双链,克隆入表达载体pslience2.0-GFP,得到重组质粒pslience2.0-GFP-sipolβ1和pslience2.0-GFP-sipolβ2。通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果:经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pslience2.0-GFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siRNA序列相同。结论:成功构建了靶向DNApolβsiRNA真核表达载体。

摘要：目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymeraseβ,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达。方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcD-NA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ。将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC 9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。结果经过PCR筛选及DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功。筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功。结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础。

摘要：目的 研制一种新型基于膜显色的芯片,用于丙型肝炎病毒(HCV)及其基因分型的快速检测。方法 根据HCV 5′端非编码区(5′NCR)设计特异型探针和引物,制作DNA芯片。实验组为60份HCVRNA阳性血清,对照组为20份健康人血清。获得目的片段后与芯片杂交,通过尼龙膜上的显色信息判读基因型。同时以测序法进行双盲HCV基因分型对照检测。 结果 实验组HCV芯片检测结果均为阳性,对照组均为阴性。实验组基因分型检测结果与测序结果两者符合率为96.7％。 结论 用DNA芯片来检测HCV基因分型具有快速、高特异性和高灵敏度的特性,可以应用于HCV及其基因分型临床检测。

摘要：目的：建立过量表达食管癌突变型（点突变型和缺失突变型）DNA聚合酶β（DNA Polymeraseβ，polβ）的EC9706细胞系，并观察其生物学特性的变化。方法：根据GenBank DNA polβ的eDNA序列设计引物，运用PCR方法，从质粒peDNA3．1-polβ中扩增出点突变和缺失突变型的DNA polβ基因，作为目的片段，定向克隆至pEGFP—N3真核绿色荧光蛋白表达载体，获得点突变和缺失突变型的重组真核表达载体pEGFP—N3-polβ。采用脂质体转染的方法，将两种突变型的pEGFP—N3-polβ转染EC9706细胞系，荧光倒置显微镜观察其细胞定位，绘制生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期。结果：成功构建了点突变型和缺失突变型pEGFP—N3-polβ重组真核表达载体，荧光倒置显微镜结果显示缺失突变型的DNA polβ表达以细胞胞浆为主，点突变型以细胞胞核为主，而且缺失突变型的细胞生长较对照组明显减慢（P〈0．05），点突变型与对照组相比则无明显差异（P〉0．05）；缺失突变型的DNA polβ还可使EC9706细胞的S期细胞明显减少（P〈0．05），而点突变型轻度减少（P〈0．05）。结论：成功建立了稳定高表达人点突变型和缺失突变型DNA polβ的EC9706细胞系，外源点突变型和缺失突变型DNA polβ在食管癌EC9706细胞表达后可以改变其生物学特性，对研究食管癌的发病机制具有重要意义。