摘要：目的利用RNA干扰技术,以人CCL20基因为靶基因,设计CCL20基因特异性的小干扰RNA(siRNA),构建其短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。方法设计并合成人CCL20基因特异性的DNA寡核苷酸,连接到经SpeⅠ和SalⅠ双酶切线性化的pHSER dsRNA GFP SIN质粒上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,进行DNA测序鉴定。结果将合成的两对人CCL20基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后,分别克隆到线性化的pHSER dsRNA GFP SIN载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下,筛选出相应的阳性菌落,经DNA测序鉴定确实为所需序列。结论构建成功了2对人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体,可进一步用于干扰CCL20基因的mRNA转录,从而为制备CCL20基因表达抑制型的人角朊干细胞奠定基础。

摘要：目的:构建针对人CC亚族趋化因子配体20(CC chemokine ligand20,CCL20)基因外显子2的置换型打靶载体。方法:设计和合成引物,利用长距离聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)从永生化人角质形成细胞系(HaCaT)基因组DNA中克隆出CCL20基因组DNA片段,再以CCL20基因为模板扩增出长度为1969bp的同源短臂和2356bp的同源长臂,分别插入ploxP载体的Neo基因上游和下游,构建针对人CCL20基因外显子2的置换型打靶载体(ploxP-hCCL20)。将打靶载体线性化并以电穿孔方法转移入HaCaT,观察克隆的形成。结果:经过PCR、限制性内切酶鉴定及DNA序列测定,证实该载体的两条同源臂包含人CCL20基因的外显子1、3、4及其邻近的部分内含子。结论:ploxP-hCCL20载体构建成功,增加Neo基因下游同源臂长度的策略有可能提高细胞基因敲除的同源重组率。