摘要：针对目前国产食品级亮氨酸氨肽酶的工业生产产量不高的现状,将米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉的5个亮氨酸氨肽酶基因(lapA、lap1O、lap2、lap1S、lap1N)在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达,通过信号肽替换对其编码区进行改造,利用杂合启动子PnaII及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,并基于规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9工具设计亮氨酸氨肽酶的基因组定点整合策略,获得高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株,重组菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力达到11 701.2 U/mL,比未利用CRISPR工具的LapA-T重组表达菌株的酶活力(2 476.0 U/mL)提高了约3.7倍。此外,通过融合6×His标签实现了重组亮氨酸氨肽酶LapA的纯化,并对其进行了酶学性质研究:蛋白质大小约为35.0 kDa,重组亮氨酸氨肽酶LapA最适pH值为8.5,最适温度为65℃。综上所述,本研究基于CRISPR策略成功实现了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重组表达。