摘要：目的建立基于荧光杂交探针和熔解曲线分析方法,检测线粒体单核苷酸多态性的快速而可靠的技术,为与帕金森病相关的环境和遗传因素相互作用的人群流行病学研究提供技术支持。方法从全血中提取线粒体DNA,设计特异性引物和荧光素标记探针,在LightCycler仪器上进行实时PCR和熔解曲线分析,根据检测探针上特异等位基因的荧光探针的熔点温度(Tm值)给样本的10个单核苷酸多态性分型,测序验证熔解曲线分析结果。结果在线粒体DNA的1719、4580、7028、8251、9055、10398、12308、13368、13708和16391位点上的野生型向突变型变化,引起检测探针的Tm值依次降低6.51、8.29、3.26、7.82、4.79、2.84、2.73、9.04、8.53和9.52℃。熔解曲线分析获得的150个基因型分析结果与测序结果100/一致。结论荧光杂交探针技术能快速和有效地检测线粒体DNA多态性。这种方法将能够用于大规模的环境流行病学研究,并有助于研究帕金森病的发病机制,识别遗传易感生物标志和保护易感人群。

摘要：目的构建N-Ras基因小发卡结构RNA(shRNA)干扰真核表达质粒载体,并初步观察其对二羟环氧苯并芘(BPDE)转化的人支气管上皮细胞(16HBE-T)生长的影响。方法根据GenBank提供的N-Ras cDNA序列,设计并合成shRNA寡核苷酸片段,与含U6启动子的pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建4个真核表达载体,并经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染16HBE-T细胞48 h后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测重组质粒对N-Ras基因表达的影响;用噻唑蓝法(MTT)观察重组质粒对细胞生长的抑制作用。结果构建了4个N-Ras shRNA真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。构建的4个表达载体pGPU6/GFP/Neo-NRas-566、pGPU6/GFP/Neo-NRas-305、pGPU6/GFP/Neo-NRas-613和pGPU6/GFP/Neo-NRas-791分别转染16HBE-T细胞48 h后,RT-PCR显示N-Ras基因mRNA表达水平依次下调95%、70%、92%和60%;Western blot显示蛋白表达依次降低92%、45%、58%和34%。MTT发现16HBE-T细胞的生长受到明显抑制,且与N-Ras基因表达水平正相关。结论成功构建了N-Ras基因特异性shRNA真核细胞表达载体,有效沉默了N-Ras在16HBE-T细胞中的表达,抑制了恶性转化细胞的生长。

摘要：目的探究mm9circ010490在PM2.5暴露小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中的表达改变及其在炎症反应中的作用。方法使用0、50、100、150、200μg/ml的PM2.5悬液暴露RAW264.7细胞24、48 h,收集细胞提取总RNA,用qRT-PCR技术检测炎症因子IL-6、TNF-α和mm9circ010490表达水平的差异。设计并合成mm9circ010490的3条干扰序列(siRNAs)对细胞进行转染,以si-NC空载体作为对照组,联合PM2.5暴露后检测上述指标。结果与对照组相比,PM2.5暴露RAW264.7细胞后,IL-6和TNF-α炎症因子及mm9circ010490的水平升高,具有时间、剂量依赖性,且差异具有统计学意义(P<0.05);使用mm9circ010490的siRNA转染RAW264.7细胞后,IL-6、TNF-α炎症因子和mm9circ010490表达水平下调,差异具有统计学意义(P<0.05);联合PM2.5暴露后,与si-NC+PM2.5组相比,上述指标呈现低表达趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 mm9circ010490表达水平在PM2.5暴露后的RAW264.7细胞中明显上升,且在PM2.5诱导细胞炎症反应中发挥着促炎作用。