摘要：成纤维细胞生长因子5(FGF5)是影响毛囊周期性活动及毛发生长的重要生长因子。本研究利用CRISPR/Cas9n系统靶向编辑绵羊成纤维细胞中FGF5基因。首先利用Gibson Assembly法将U6启动子引导表达单导向RNA(sgRNA)的原件构建至pX461质粒中,获得pX461-U6质粒;再将设计并合成好的1对靶向FGF5基因第3外显子的sgRNA及其互补链,经退火连接形成sgRNA-sg1和sgRNA-sg2双链后,分别克隆至带有BbsⅠ和BsaⅠ黏性末端的pX461-U6质粒。构建好的重组质粒pX461-U6-sg1+sg2经测序鉴定后,以电转染的方式转入绵羊成纤维细胞,72 h后收集细胞进行检测分析。经T7E1酶切检测分析表明,成功获得1对具有靶向效果的sgRNA,PCR扩增的FGF5基因片段经TA克隆后进行测序鉴定,结果sgRNA-sg1+sg2在靶位点的打靶效率为100%;缺失的核苷酸数从10到64个不等;基于预测的3D模型和RT-PCR结果显示,FGF5基因的突变将会影响FGF5蛋白与其受体的结合,导致FGF5蛋白失去其生物学功能。本研究构建了可以在同一载体中同时表达2条sgRNA和Cas9n以及绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,瞬时转染至绵羊成纤维细胞后,成功获得了高效靶向绵羊FGF5基因的sgRNA位点,为精确和高效的靶向基因工程提供了科学依据。

摘要：肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)可负调控骨骼肌的发育。本研究利用胞嘧啶碱基编辑器(cytidine base editor,CBE)在哈萨克羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子,以期达到敲除MSTN基因的目的。共设计2条靶向哈萨克羊MSTN基因不同外显子的sgRNAs,分别连接至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒,并与pCMV-AncBE4 max-P2A-GFP质粒共转染哈萨克羊胎儿成纤维细胞,经CruiserTM酶酶切检测、Sanger测序和TA克隆分析。结果显示,成功筛选出可以在哈萨克羊MSTN基因外显子提前引入终止密码子的2条sgRNAs,其中STOPsg-1靶位点编辑效率为26.7%,STOPsg-2靶位点的编辑效率为6.7%。本研究成功运用CBE(AncBE4 max)技术在哈萨克羊胎儿成纤维细胞MSTN基因编码区实现定点编辑,为培育精确编辑MSTN基因的哈萨克羊奠定基础。

摘要：研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊(Ovis aries)成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor 5,FGF5)基因第1外显子以引入终止密码子,获得定点编辑类型的绵羊胚胎,为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA(single guide RNA,sgRNA)寡核苷酸链(sgRNA-T1~sgRNA-T4),构建4组不同的重组表达载体;将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞,随后用CruiserTM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示,sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被CruiserTM酶酶切,且测序结果表明都具有靶向效果,编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中,并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率,结果显示,胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max(ng/μL)∶sgRNA(ng/μL)=100∶50,从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示,引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子,通过在成纤维细胞转染表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA(T1、T4);通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎,成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变,为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。