摘要：背景:研究表明叉头转录因子1是一种新的2型糖尿病易感基因,但2型糖尿病患者与健康人的叉头转录因子1基因在转录水平上差异性的研究不多。由于还没有商品化叉头转录因子1的质粒标准品,因此有必要构建其标准品。目的:构建应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测叉头转录因子1mRNA的质粒标准品。设计、时间及地点:单一样本重复实验,于2007-11/2008-03在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成。材料:SYBRExScriptTM反转录-聚合酶链反应Kit试剂盒,SYBRPremixExTaqTM试剂盒,凝胶回收纯化DNA试剂盒,质粒DNA小量纯化试剂盒,PMD18-TVector试剂盒等。方法:从健康志愿者血标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板应用聚合酶链反应扩增出目的片段,对其回收纯化连接到PMD18-T载体及转化JM109,阳性克隆经测序分析,确认重组质粒正确。抽提重组质粒,用紫外分光光度仪测定其浓度,再根据公式换算成拷贝浓度,最后稀释成梯度标准品。主要观察指标:重组质粒聚合酶链反应和基因测序结果,标准品标准曲线的相关系数及标准品的重复性。结果:成功构建了叉头转录因子1质粒标准品,通过聚合酶链反应及基因测序鉴定其目的片段已成功插入载体。各稀释度的标准品经荧光定量-聚合酶链反应扩增后,其循环阈值与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性范围是2.39×(105～1012)copies/mL。各稀释度标准品的批内重复性好,其变异系数范围为0.29%～1.16%。结论:实验成功构建了具有较好灵敏度和重复性的叉头转录因子1质粒标准品。

摘要：【目的】探明苏氨酸(Thr)水平对1~4和5~7周龄兴义矮脚鸡生长和养分代谢的影响,为兴义矮脚鸡饲养标准的制定奠定基础。【方法】采用单因子设计,选取144只0日龄健康、体重相近的兴义矮脚鸡雏鸡,随机分成4组,1~4周龄1~4组兴义矮脚鸡分别饲喂苏氨酸水平为0.80%、0.87%、0.94%、1.07%饲粮,5~7周龄饲喂水平分别为0.70%、0.80%、0.90%、1.0%,测定兴义矮脚鸡的生长性能和养分代谢率。【结果】在1~4周龄,随着Thr水平提高,兴义矮脚鸡的日增重(ADG)和日均采食量(ADFI)随之增加,1.07%和0.94%水平组ADG和ADFI均显著高于0.87%和0.80%组(P0.05),料重比(F/G)以0.70%水平的最低(P<0.05),显著低于其他3组。【结论】兴义矮脚鸡在1~4周龄时,苏氨酸适宜水平为0.94%;5~7周龄,适宜苏氨酸水平则为0.90%。

摘要：背景:目前,对CD40/D40L的研究主要集中在可溶性和蛋白方面,对其在转录水平上的研究文献不多,可能与其无商品化质粒标准品有关。目的:构建检测CD40/CD40L mRNA表达水平差异的标准品。设计、时间及地点:单一样本实验,于2009-04在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成。材料:取手术切除的子宫肌瘤组织,经患者知情同意。方法:以手术切除的子宫肌瘤组织细胞的总RNA为模板、Random6mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人CD40/CD40L基因相应的cDNA片断,构建PMD-18-CD40/CD40L重组质粒,鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线。主要观察指标:①RNA质量检测结果。②扩增的目的片段电泳结果。③CD40/CD40L基因测序结果。④标准品的扩增情况。结果:组织提取的总RNA完整性良好,构建的CD40/CD40L质粒经PCR扩增后分别得到136bp,200bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为2.66×1013、2.45×1013copies/mL,倍比稀释至2.0×106copies/mL均能得到良好的标准曲线(R2=1)。结论:实验成功构建了CD40/CD40L基因荧光定量PCR标准质粒。

摘要：选择与羊同源性较高的牛RERGL基因组序列设计特异性引物,提取黔北麻羊脾脏总RNA,通过RT-PCR技术对RERGL基因进行克隆测序及序列分析。结果表明,成功克隆了黔北麻羊RERGL基因,其cDNA序列646 bp,GenBank登录号JN 671919,编码205个氨基酸。生物信息学分析表明,黔北麻羊RERGL基因蛋白二级结构α-螺旋占40.68%,延伸链占16.18%,无规则卷曲占43.14%;没有跨膜螺旋结构域且没有糖基化位点。

摘要：本研究旨在对黔北麻羊肌细胞增强因子2D(myocyte enhancer factor 2D,MEF2D)基因的多态位点进行筛选及生物信息学分析。根据GenBank中山羊MEF2 D基因序列(登录号:NC_030810),应用Primer Premier 5.0软件设计引物,运用混合DNA池结合PCR产物直接测序分析黔北麻羊MEF2D蛋白第2~6外显子序列多态性,构建系统进化树,并利用生物信息学软件对黔北麻羊MEF2D蛋白进行理化性质、疏水性、跨膜结构、信号肽和二级结构分析。结果显示,共筛选出3个SNPs:Exon3-G17617A、Exon5-C20180A和Exon5-C20259T。系统进化树分析显示,黔北麻羊和黄牛的亲缘性最近,与野猪和人的亲缘关系较近,与褐家鼠和小家鼠的亲缘关系较远。蛋白理化性质分析显示,黔北麻羊MEF2D蛋白理论等电点为7.74,亲水值最小为-2.867,疏水值最大为1.933,为非跨膜蛋白,无信号肽。二级结构显示,Exon5-C20180A突变导致黔北麻羊MEF2D蛋白质二级结构中α-螺旋和延伸链增加,β-转角和无规则卷曲减少。本研究成功筛选出黔北麻羊MEF2 D基因多态位点,为研究黔北麻羊育种的分子遗传标记辅助选择奠定基础。

摘要：本研究旨在对黔北麻羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4)基因的多态位点进行筛选及生物信息学分析。根据GenBank中山羊Tβ4基因序列(登录号:NC_030810和NW_017189516),应用Primer Premier 5.0软件设计引物,运用混合DNA池结合PCR产物直接测序获得黔北麻羊Tβ4基因X染色体第1、2、3外显子和3号染色体第1外显子序列进行多态性分析,利用生物信息学分析软件对黔北麻羊Tβ4基因进行同源性、系统进化树、理化性质、疏水性、卷曲螺旋、跨膜结构、信号肽、亚细胞定位、结构域、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构和三级结构分析。结果显示,共筛选出10个SNPs,分别为:G55C、C82T、G112A、C129T、G216A、G431A、G551T、T579A、A609G和A619G。同源性比对分析结果显示,黔北麻羊与黄牛、马、野猪、人、裸滨鼠、褐家鼠、小家鼠和原鸡Tβ4基因核苷酸序列同源性分别为97.8%、96.3%、95.6%、94.1%、94.8%、91.1%、92.6%和86.7%。蛋白理化性质分析显示,黔北麻羊Tβ4蛋白理论等电点为5.02,亲水值最小为-3.011,无疏水性氨基酸,无卷曲螺旋,不是跨膜蛋白,无信号肽存在,分布在细胞核(60.9%)、线粒体(4.3%)、细胞骨架(17.4%)和细胞质(17.4%),有1个THY结构域,有1个苏氨酸磷酸化位点,无N糖基化位点,有4个O糖基化位点。二级结构分析显示,C129T突变使其蛋白质二级结构中α-螺旋增加,无规则卷曲减少。本研究成功筛选出黔北麻羊Tβ4基因多态位点,为研究黔北麻羊育种的分子遗传标记辅助选择提供了参考依据。

摘要：为了解山羊TGFB3基因的多态性,并为优秀山羊品种的选育提供理论依据,选择牛TGFB3基因组序列(NM_001101183)设计1对特异性引物,采用DNA池PCR直接测序法快速检测黔北麻羊、内蒙古白绒山羊和关中奶山羊3个山羊品种的TGFB3基因的多态性。结果表明,只在黔北麻羊TGFB3基因第1外显子212bp处发现1个多态性(SNP)位点(G-212-A)。利用生物信息学分析TGFB3基因5’侧翼调控序列,转录因子结合位点96分以上的有28个(CdxA有2个,HSF有18个,ADR1有2个,AML1a有1个,GCR11有3个,cap有1个,RY有1个),在TGFB3基因5’调控区没有发现CpG island。

摘要：选择与羊同源性较高的牛ras相关的雌激素调节的生长抑制因子(ras-related estrogen-regulated growth in-hibitor,RERG)基因组序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术对RERG基因进行克隆测序及生物信息学分析。结果显示,克隆了羊RERG基因cDNA序列629bp,完整的开放阅读框(ORF)为20～620bp,其编码199个氨基酸。GenBank登录号分别为JN672576、JQ917222和JN580309。通过实时荧光定量RT-PCR技术分析RERG基因在贵州三大地方品种同一年龄段不同组织中的表达情况。结果表明,成年羊肺脏和脾脏表达量是最高,胸腺表达量最低,肌肉表达量为相对中度表达。为进一步研究地方品种羊生长性状的改善提供科学依据。

摘要：选择与羊同源性较高的牛独立生长因子1B(GFI1B)基因序列设计特异性引物,提取贵州黑山羊脾脏总RNA,通过RT-PCR技术对GFI1B基因进行克隆测序及序列分析。结果表明:首次克隆了贵州黑山羊GFI1B基因cDNA序列996 bp,GenBank登录号为JN662390,编码331个氨基酸。贵州黑山羊GFI1B基因与牛的同源性高达97.0%。聚类分析显示:哺乳动物、禽类和两栖类各为一类。生物信息学分析表明:山羊GFI1B分子包括1个低组分复杂性区域、6个锌指结构域ZnF-C4。同时,预测结果还表明GFI1B分子不包含信号肽序列且没有跨膜螺旋结构域,26个磷酸化位点,蛋白糖基化位点有7个。

摘要：选择与羊同源性较高的牛RERG基因组序列设计特异性引物,提取黔北麻羊脾脏总RNA,通过RT-PCR技术对RERG基因进行克隆测序及序列分析。结果表明:首次克隆了黔北麻羊RERG基因cDNA序列629 bp,GenBank登录号为JN672576,该基因共编码199个氨基酸。黔北麻羊RERG基因与牛的RERG基因同源性高达98.5%。聚类分析显示:哺乳动物、禽类和两栖类各为一类。该聚类结果与动物间遗传距离大小一致,也与各动物在动物学上的分类相吻合,说明RERG基因编码区适于构建种间系统进化树。