摘要：RNAi在HIV-1的治疗研究中得到了广泛的应用,构建高效并且安全的RNAi抗病毒元件是开展相关研究的基础。vif37是以前的研究中筛选获得的靶向HIV-1 vif的高抑制效率兼具保守性的RNAi靶点。miRNA在抑制效率和启动子的选择上比常用的shRNA具有优势。本研究探索以人工miRNA结构引发vif37靶点对应的RNAi。本研究以天然的miR-155前体为骨架,采用步移的方式设计了3个靶向vif37的人工miRNA,以RNA聚合酶Ⅱ类启动子指导表达。miRNA表达质粒和HIV-1的感染性克隆pNL4-3共转染的结果显示,3个人工miR-NA中只有miR-vif37H具有抑制效果,效率与shRNA-vif37相当。与携带靶序列的荧光素酶报告质粒共转染实验证明miR-vif37H具有良好的抑制特异性。用表达miR-vif37H的重组慢病毒转导HIV-1的敏感细胞MT-4,克隆化后获得稳定表达miR-vif37H的细胞株MT-4-miR37H,该细胞可以有效抑制HIV-1的体外复制。实时RT-PCR检测结果显示,与shRNA-vif37相比,miR-vif37H的表达水平明显下降,安全性更好。进一步的实时RT-PCR检测结果还显示,miR-vif37H在细胞内的稳定表达不会影响内源代表性miRNA(miR-181和miR-16)的加工以及干扰素应答相关基因Stat1的mRNA水平。miR-vif37H是一个特异的高效RNAi元件,为vif37靶点的进一步应用研究奠定了基础。

摘要：RNAi技术在艾滋病治疗研究中已展现出巨大的潜力,兼具高效抑制特性和保守性的siRNA靶位是其获得成功应用的重要基础。本研究选择以HIV-1 vif基因为靶区筛选高效保守的RNAi序列,共选择设计了30个识别不同位点的siRNA序列,以pSUPER为载体构建了相应的shRNA表达质粒。通过与pNL4-3质粒在293FT细胞中进行共转染抑制实验,以及对初筛获得的高效序列进行保守性分析显示siRNA-vif37序列具有高效抑制效率和较好的保守性特征。通过与pGL3-vif报告质粒的共转染实验证明siRNA-vif37具有vif基因抑制特异性。带有shRNA-vif37表达元件的重组慢病毒转导后的MT-4细胞在HIV-1NL4-3体外攻毒实验中可显示出较有效的抑制病毒复制的能力,本研究进一步对转导后细胞进行克隆化筛选,获得稳定整合shRNA-vif37表达元件的MT-4-vif37细胞克隆,该细胞具有显著的抑制病毒复制的能力,在高攻毒剂量下仍可获得良好的抑制效果。本研究为进一步应用RNAi技术进行新型艾滋病治疗方法研究提供了重要基础。