摘要：报道了带有人凝血因子IX cDNA的高滴度高表达安全性反转录病毒载体的构建。采用LNL6反转录病毒载体为骨架,构建了由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动的反转录病毒载体LNCIX,由反转录病毒LTR启动子驱动的反转录病毒载体LIXSN,以及由LTR和CMV启动子共同控制转录的反转录病毒载体LCIXSN,分别用电穿孔方法转导PA317辅助细胞株。LNCIX和LIXSN反转录病毒载体能在离体细胞中表达人IX因子蛋白,而LC'IXSN反转录病毒载体转移到离体细胞中没有检测到人IX因子蛋白。PA317/INCIX细胞的产病毒滴度为8×10~5CFU/ml,该重组病毒感染人纤维肉瘤细胞HT1080及血友病B患者皮肤成纤维细胞(HSF),用ELISA方法分别测定这些细胞的IX因子蛋白产量,LNCIX载体在HT-1080细胞中的人IX因子平均表达量为3.3μg/10~6细胞·d^(-1);在HSF细胞中的平均表达量为2.5μg/10~6细胞·d^(-1),其中80％以上的IX因子具有凝血活性,与过去相比,提高了产病毒滴度,增加了人IX因子的平均表达量,病毒载体骨架的设计更完善,降低了产生野生型病毒的概率,提高了安全性,对于进一步开展血友病B的基因治疗具有重要的意义。

摘要：背景:phiC31是重要的基因治疗工具酶,其与细胞内蛋白的相互作用可能影响细胞内各种通路,从而关系到基因治疗的安全性。目的:构建锌指蛋白403基因原核表达载体,观察其在真核细胞的表达情况。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-10/2008-12在复旦大学遗传工程国家重点实验室完成。材料:大肠杆菌DH5α菌株及大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株均为实验室保存。方法:用pLexA-phiC31作为"诱饵",对人胎脑cDNA文库通过酵母双杂交进行筛查,分离阳性克隆。对锌指蛋白403基因构建原核表达载体并纯化鉴定。脂质体介导真核细胞进行转染并细胞定位观察。主要观察指标:锌指蛋白403的原核表达载体的构建、纯化及在真核细胞细胞质中定位的结果。结果:酵母双杂交进行筛查后分离61个阳性克隆中,有1个包含17号染色体17q12上的基因序列,其具有一个锌指结构,故名锌指蛋白403。成功构建了锌指蛋白403的原核表达载体,并纯化组氨酸标记的锌指蛋白403。在真核细胞中,构建了绿荧光融合载体,证明了此蛋白在细胞质中的定位。结论:实验结果发现了一个新的phiC31整合酶相互作用蛋白,成功构建了znf403基因的原核表达载体,znf403蛋白主要在细胞质中聚集和分布。

摘要：根据cFⅨcDNA(canineFⅨ ,cFⅨ )顺序设计引物 ,采用RT PCR技术 ,从狗肝细胞中提取mRNA ,逆转录成cFⅨcDNA ,克隆到pGEM T质粒载体上 ,经DNA顺序分析 ,挑选克隆 ,拼接并测序鉴定 ,得到DNA顺序完全正确且含有cFⅨ完整编码区的cDNA ,进一步构建成以G1Na为框架的反转录病毒载体G1NaCcⅨ (hCMV启动子控制cFⅨ转录 )和G1NaMBcⅨ (MCK增强子和β actin启动子共同控制cFⅨ转录 ) ,并用于反转录病毒介导的基因转移 .狗原代皮肤成纤维细胞实验结果显示 ,cFⅨ能够在狗皮肤成纤维细胞中表达 ,表达水平分别为G1NaCcⅨ :173ng/ 10 6 细胞·2 4h ;G1NaMBcⅨ :2 11ng/ 10 6 细胞·2 4h .此结果为血友病B狗基因治疗动物试验的开展奠定了基础 .

摘要：对临床上确诊为M2－ANLL（acutenon－lymphocyteleukemia）的病例，首先进行骨髓细胞染色体的核型分析，经G显带和R显带确定为t（8；20）（q22；P23）易位，是一种新的变异型．为进行分子生物学研究，分别设计引物，反转录扩增检测ETO基因CDNA3’-端顺序和AML；－ETOM合转录物．实验证明了该易位为8号染色体上的ETO基因受累，但AML1－ETO融合转录物检测为阴性，从分子水平上排除了经典的t（：21）易位的可能性．说明了该病例为t（8；20）易位。ETO基因受累的新变异型白血病。