摘要：目的对屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)8类变应原Der p 8进行克隆表达、纯化及免疫原性分析,并用生物信息学方法分析其同源性。方法根据已知Der p 8基因序列,设计PCR引物;提取屋尘螨总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到Der p 8的cDNA片段,以cDNA和设计的引物进行PCR扩增;扩增产物连接至T载体并转化入大肠埃希菌(*** Top10)中,培养后挑选阳性单克隆菌落测序。测序正确后,转入表达载体pET-32a,经酶切鉴定、测序后转入表达菌BL21,大量表达重组蛋白Der p 8。用亲和层析法纯化后进行免疫印迹分析(Western blotting)。利用生物信息学方法分析Der p 8基因的同源性。结果酶切鉴定显示Der p 8表达载体构建成功,目的基因分子量约为700 bp;SDS-PAGE电泳显示Der p8重组蛋白成功表达,分子量约为38 kD,且主要以包涵体形式存在。Western blotting结果显示Der p 8重组蛋白具有免疫原性。同源性分析结果显示本实验克隆Der p 8基因与NCBI基因库的Der p 8基因同源性为76.97%。结论本实验成功克隆表达并纯化出具有免疫原性的Der p 8重组蛋白,为临床上应用重组蛋白于诊断和治疗提供理论基础。

摘要：本文提出了一种使用一型模糊规则生成区间二型TSK(Takagi-Sugeno-Kang)神经模糊系统的新方法.该方法以训练数据集与使用自组织方法由该训练集训练生成的一型模糊系统为驱动,通过新型模糊系统前件类型转换算法与规则参数自适应学习算法的训练,在不高于原一型系统模糊集合总数前提下,自主构建区间二型TSK神经模糊系统.此外,针对两种典型的多输入单输出和多输入多输出系统,在3种不同强度的系统扰动场景下进行了对比仿真实验.实验结果表明,在含有不同扰动状态系统的建模与辨识中本方法较于对比方法具有更加优异的性能.

摘要：非线性系统理论的实际工程需求和复杂性使其成为控制学科中最具吸引力和挑战性的研究领域,为此介绍了一种新的非线性控制律设计方法——浸入与不变(I&I)理论.该方法首先选择一个比被控系统维数低的(局部)渐近稳定的目标系统,然后设计浸入映射和控制律,使得原系统在控制律作用下的动态轨迹都是目标系统在浸入映射下的像,并且该控制律能够保持目标系统的像为不变吸引流形,且使闭环轨迹有界.针对未知点质量模型,设计了一种新的非线性浸入与不变自适应控制律,实现了对参考指令的精确跟踪.将其与基于确定等价原则的自适应控制律相比较,仿真结果表明,所设计的浸入与不变控制律能够更好地处理带有未知参数的系统.

摘要：目的克隆腐食酪螨第13组变应原基因(Tyr p 13),表达纯化其重组蛋白,并进行免疫学特性鉴定,利用生物信息学软件分析该过敏原抗原表位等信息。方法挑取腐食酪螨,提取螨总RNA。逆转录-聚合酶链式反应(RTPCR)扩增cDNA,根据已知的Tyr p 13基因序列(GeneBank登录号AY710432.1)设计引物,PCR大量扩增目的基因。构建原核表达载体pET-32a(+)-Tyr p 13,转化感受态细胞E. coli Rosetta(DE3),用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导目的蛋白表达;层析纯化表达产物,免疫印迹(Western Blot)法检测纯化后的表达产物免疫学活性;通过生物信息学软件推测其抗原表位、构建进化树。结果克隆得到的序列经基因测序可知其长度约400 bp,其表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分子量约为14 kD,呈可溶性表达。免疫印迹结果显示,Tyr p 13能够与过敏患者血清IgE特异性结合,表明其具有过敏原性;表位分析进一步证实该过敏原具有免疫原性。结论经克隆表达、纯化后得到纯度较高的腐食酪螨Tyr p 13,为进一步开展临床特异性诊断和治疗提供参考。

摘要：目的克隆表达及纯化屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Der p)第13组变应原(Der p13)蛋白,并鉴定其免疫原性。方法提取屋尘螨总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得Der p13的cDNA片段。正确设计引物,利用已获得的cDNA片段进行PCR扩增,获得Der p13基因片段。将扩增产物连接到载体上并转入克隆菌Top10中,挑选阳性菌落,保菌取样送到上海生工生物有限公司进行测序。将测序正确的基因转入表达载体PET-24a中,经Bam H I、Xho I双酶切后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达和镍柱亲和层析法纯化重组蛋白Der p13。使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及免疫印迹(Western Blot)鉴定纯化产物。结果成功构建表达了质粒PET-24a-Der p13,SDS-PAGE电泳结果显示上清可溶性蛋白表达量较多,分子质量约为13000。免疫印迹结果表明该蛋白可与尘螨过敏患者血清结合,具有一定免疫原性,重组蛋白Der p13三级结构预测表明其主要是β折叠,根据DNAStar抗原指数、亲水性、表面可及性、柔韧性等数据可以推导出蛋白Der p13抗原区,重组蛋白Der p13进化树分析结果显示屋尘螨与粉尘螨、疥、害嗜鳞螨及储存螨同源性较高。结论成功克隆表达、纯化出Der p13重组蛋白,该蛋白具有一定的免疫原性,为临床实验研究过敏性疾病的诊断与治疗奠定基础。

摘要：蛋白质翻译后O-糖基化修饰普遍存在于真核生物、细菌和古细菌,多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(polypeptide:N-acetylgalactosaminyltransferase 2,ppGalNAc-T2)是O-糖基化反应的限速酶。基因组数据分析揭示艾美耳球虫具有O-糖基化反应途径。为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)蛋白质翻译后糖基化修饰及其关键酶的药靶效用,对Et ppGalNAc-T2基因进行了克隆,并检测其在***不同发育阶段的表达动态。根据EuPathDB中所预测Et ppGalNAc-T2基因序列设计引物,以RT-PCR方法扩增获得Et ppGalNAc-T2的ORF,插入酶切位点后连接到原核表达载体pGEX-6p-1进行诱导表达。提取***广东株未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子5个发育阶段的总RNA,以qRT-PCR法检测Et ppGalNAc-T2转录水平的动态变化。结果表明,Et ppGalNAc-T2的全长ORF为1 983bp,编码660个氨基酸,在*** Transetta(DE3)可溶性表达。qRT-PCR结果显示,Et ppGalNAc-T2转录水平随发育阶段不同而有显著差异,子孢子阶段表达水平最高、而在孢子化卵囊则几近不能检出。结果为进一步研究EtppGalNAc-T2的功能提供了试验基础。

摘要：为了克隆表达纯化鸡颗粒溶素（chicken granulysin,ChGNLY）并进行活力鉴定。本试验以基因组数据库预测的ChGNLY基因为模板设计引物,对提取的鸡脾脏总RNA进行RT-PCR,扩增得到的ChGNLY基因插入pMD-19T载体中并测序。将测序正确的GNLY基因克隆至pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GNLY,并将其转化至感受态BL21,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE、Western-blotting和蛋白质谱鉴定融合蛋白的正确性。CellTiter-Glo2.0Assay检测融合蛋白的生物学活性。另外,对GNLY的分子特性进行了生物信息分析。结果显示,测序结果显示克隆的ChGNLY片段长237bp,编码79个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约为36 000。重组ChGNLY融合蛋白能特异性与人颗粒溶素抗体发生反应。纯化后的GNLY融合蛋白经CellTiter-Glo2.0Assay检测,发现其具有剂量依赖性的细胞毒活性。系统发生分析显示GNLY可明显分为4个群。结构分析发现,ChGNLY活性区域表面带有大量正电荷,且位点保守。结果表明,本试验利用原核表达系统成功表达了具有生物学活性的ChGNLY,为ChGNLY后续功能的研究奠定理论基础。