摘要：目的构建表达免疫活性的尿素酶功能片段原核表达体系。方法根据尿素酶B基因序列以及文献报道的尿素酶活性中心区域,primer5.0设计相应的引物,以Hp基因组为模版,PCR扩增拟表达的尿素酶活性片段,经测序证实后将片段亚克隆于原核表达载体pET28中,转入宿主菌BL21后IPTG诱导表达后,Tris-Tricine PAGE电泳及抗Hp特异性抗体western-tbollting鉴定目的蛋白表达。结果PCR从Hp基因组中扩增出414bp目的片段,经酶切及测序证实构建了功能片段表达阳性重组子,命名为pU414,IPTG诱导后电泳分析可以发现相应分子量附近出现可疑目的蛋白,能够被特异性血清识别。结论成功建立尿素酶活性功能片段蛋白表达载体,为下一步实验研究奠定基础。

摘要：背景:间充质干细胞的免疫抑制作用近年来逐渐得到证实并开始应用于临床,但相关研究成果主要来源于体外细胞实验。目的:观察同种异基因大鼠骨髓间充质干细胞从静脉输入后对体内CD4+CD25+调节性T细胞的影响。设计、时间及地点:以动物为对象的对照观察实验,于2008-03/09在南方医科大学珠江医院移植免疫研究所完成。材料:Wistar大鼠6只用于制备骨髓间充质干细胞,SD大鼠20只作为输注骨髓间充质干细胞的受体鼠。方法:从Wistar大鼠骨髓分离培养间充质干细胞,取第3~5代细胞进行实验。①体外淋巴细胞增殖实验:首先将间充质干细胞悬液从尾静脉注入SD大鼠体内10d后脱臼处死,取大鼠脾脏制备脾淋巴细胞。实验分5组:分别为脾淋巴细胞/骨髓间充质干细胞为1∶10,1∶50,1∶100+ConA5μg组,脾淋巴细胞+ConA5μg组(增殖组),单纯淋巴细胞组(空白组),检测共培养体系中CD4+CD25+/CD4+T淋巴细胞比率。②体内注射骨髓间充质干细胞实验:将5×109L-1,5×108L-1,5×107L-1间充质干细胞及PBS静脉输入SD大鼠体内,10d后取受体鼠胸腺、脾脏、外周血检测CD4+CD25+/CD4+T淋巴细胞比率。主要观察指标:①淋巴细胞增殖体系中CD4+CD25+/CD4+比率的变化。②SD大鼠胸腺、脾脏、外周血CD4+CD25+/CD4+比率的变化。结果:①体外淋巴细胞共培养体系中,1∶10组T细胞亚群CD4+CD25+/CD4+细胞百分率较增殖组显著升高(P<0.01)。②体内输注间充质干细胞达5×109L-1的受体鼠外周血和脾脏CD4+CD25+/CD4+T细胞比率上升,与输注PBS组相比有显著差异(P<0.05),而在胸腺中各组比率无明显差异。结论:高浓度同种异基因大鼠间充质干细胞不仅可以在体外实验中增加CD4+CD25+/CD4+T细胞比率,静脉输入后仍具有相同作用。

摘要：目的:通过对基层医院使用中的生化检测系统进行性能评价,了解基层医院生化仪使用状态,建立基层医院国产生化设备的评估方法。方法:参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)颁布的不同评价文件,建议规范化评价方法,以丙氨酸氨基转移酶(ALT)等16项常用临床检测项目为指标,从精密度、分析测量范围、干扰实验及携带污染等方面对检测系统进行全面评估,并与全封闭的罗氏生化分析仪比对以评价系统准确度。结果:所有评价项目批内CV均0.95,但尿素和葡萄糖两项在医学决定水平处的误差不能满足要求,另外5个项目的相关系数<0.95。结论:基层国产生化仪在正常使用情况下能够满足日常检测对检测系统的要求,部分项目由于量值溯源或检测方法的不同需要通过建立比对和验证程序来增加结果的可比性,建立的评价方法可以用来评估基层其他的生化检测系统。

摘要：为建立肿瘤内皮标志物1(tumor endothelial marker 1,TEM 1)ELISA检测方法,依据TEM 1基因胞外区片段序列及原核表达载体pMAL-p5x多克隆位点设计引物,采用PCR技术从含TEM 1全长基因载体中扩增目的片段,将双酶切的目的基因和载体经胶回收连接后插入表达载体并经测序鉴定,在转入宿主菌后用IPTG诱导目的蛋白表达,用分离纯化后的目的蛋白分别免疫鼠和兔以制备多克隆抗体并用ELISA和流式细胞术对抗体进行鉴定,采用兔抗TEM1为捕获抗体、鼠抗TEM 1为检测抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法,棋盘滴定法探索各抗体最佳工作浓度,倍比稀释TEM 1,检测建立方法的灵敏度。成功构建的重组表达质粒pMAL-p5x-hCD248,经纯化复性后获得目的蛋白,免疫后获得兔多抗抗体效价为1∶1 024 000、鼠多抗抗体1∶512 000,棋盘法确定捕获抗体、检测抗体及酶标抗体最佳浓度分别为1∶500、1∶16 000和1∶20 000,经检测证实该方法测定下限为18.31ng/mL;检测50例恶性肿瘤患者与50例健康人血清TEM 1含量,发现差异无统计学意义。