摘要：建立快速检测致泻性大肠埃希氏菌的(DEC)方法,根据DEC的uidA(GenBank:JQ068101.1)、bfpB(Sequence:NG_034726.1)、eaeA(GenBank:AJ579305.1)、LT(GenBank:M17873.1)、ST(GenBank:M18346.1)、Stx1(GenBank:FR875155.1)、Stx2(GenBank:AB030484.1)、ipaH(GenBank:JQ638638.1)、aggR(GenBank:Z32523.1)设计引物和探针,建立基于TaqMan探针荧光PCR检测方法。用uidA基因检测所有DEC,A体系4个基因bfpB、eaeA、LT、ST检测EPEC和ETEC,B体系4个基因ipaH、Stx1、Stx2、aggR检测EIEC、STEC和EAEC,两个体系探针的5′端分别标记FAM、VIC、TET和ROX。试验结果表明,两个体系扩增效率89.6%~102.2%,线性相关系数R2在0.965~0.999范围,可准确鉴别出25株DEC型别,而70株非DEC扩增结果阴性。本研究所建立方法的特异性强,可准确检测EPEC、ETEC、EIEC、STEC和EAEC。

摘要：目的:建立同时检测副溶血性弧菌(VP)和其毒力基因的方法。方法:根据VP的toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应扩增体系,进行特异性、敏感性实验,并用建立的方法检测从广东地区和辽宁地区进出口食品中分离的VP菌株的毒力基因分布情况。结果:VP标准菌株和3株从食物中毒病人中分离株均出现toxR基因和tdh基因扩增曲线,而31株包括溶藻弧菌、单增李斯特菌等弧菌属和肠杆菌科的菌株扩增结果呈阴性;敏感性实验结果表明,VP浓度与Ct值有很好的反向的线性关系,toxR和tdh线性方程的R2分别为0.999、0.997,最低检测浓度达到3.6×102CFU/mL;检测食品中分离的37株VP只出现toxR基因扩增曲线,未见tdh基因扩增曲线,表明37株VP分离株均未带tdh毒力基因。结论:建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中VP的特异性及毒力基因检测。

摘要：目的建立基于Taq Man探针四重荧光PCR检测甲型、乙型、丙型副伤寒和伤寒沙门菌的方法。方法根据甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi A,SPA)、乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B,SPB)、丙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi C,SPC)和伤寒沙门菌(Salmonella typhi,ST)的特异序列分别设计引物SPAP、SPBP、SPCP和STP,在探针的5'端分别标记TET、ROX、FAM、HEX,建立基于Taq Man探针四重荧光PCR检测方法。结果 SPAP、SPBP、SPCP和STP分别扩增出5株SPA、4株SPB、7株SPC和11株ST,而其他血清型沙门菌和17株非沙门菌扩增结果阴性。SPAP、SPBP、SPCP和STP扩增效率分别为84.5%、101.8%、92.4%和90.9%,线性相关系数(R^2)分别为0.996、0.975、0.996和0.984。结论建立的方法特异性高、敏感性强,可用于SPA、SPB、SPC和ST的特异性检测。

摘要：目的建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法。方法根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5'端标记FAM、SE探针的5'端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性。ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2%,R2分别为0.998和0.995,最低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml。结论建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测。

摘要：目的建立结合PCR-焦磷酸测序检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。方法根据单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因设计扩增引物和测序引物,特异地扩增目的片段,再制备单链模板,在测序引物引导下进行焦磷酸测序,通过测序结果与GenBank中的hly基因序列的比对进行鉴定。结果扩增引物和测序引物表现出良好的特异性,16株单核细胞增生李斯特氏菌菌株均扩增出大小249 bp的DNA片段,焦磷酸测序结果与hly基因序列100%匹配,而阴性对照菌株均未扩增出DNA条带,焦磷酸测序结果为阴性。结论建立的方法特异性高,是快速从DNA序列水平上检测单核细胞增生李斯特氏菌的有效手段。

摘要：建立基于TaqMan探针双重重实时荧光PCR检测肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,SP)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,SE)的方法。根据SP的aceA基因(Gen Bank:U43344.1)、肠炎沙门氏菌特异序列SEP(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,在ace A探针的5′端标记FAM和SEP探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。试验结果,58株29种不同血清型肠道沙门氏菌均扩增出ace A基因扩增曲线,SEP特异性地扩增出15株SE,而28种不同血清型沙门氏菌和17株变形杆菌等阴性对照株扩增结果均为阴性。ace A和SEP的双重荧光PCR扩增效率分别为100%和104%,R2分别为0.999和0.998,最低检测浓度分别达到280 cfu/m L和260 cfu/m L。建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31 h完成,是快速检测SP和SE的有效方法,可用于食品中SP和SE的特异性检测。

摘要：目的:建立多重PCR(Multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High-Performance Liquid Chromatography,DHPLC)检测副溶血性弧菌的方法,并了解该菌携带毒力基因的情况。方法:根据副溶血性弧菌的毒力基因tdh、trh和种特异性基因toxR进行引物设计,以其单一PCR扩增产物在DHPLC出现的色谱峰作为标准色谱峰,建立MPCR-DHPLC的检测方法。结果:该方法能有效扩增副溶血性弧菌的tdh、trh和toxR基因,25株副溶血性弧菌的MPCR扩增产物经DHPLC分析所得的色谱峰在位置和峰型与标准色谱峰有很好的符合性,其他菌属的菌株均无特异性扩增,对模拟污染样品可正确检测,灵敏度达到1*103CFU/ml,特异性达到100%。结论:本文建立的MPCR-DHPLC方法可准确检测副溶血性弧菌,并了解该菌携带毒力基因的情况。

摘要：建立实时荧光PCR检测丙型副伤寒沙门氏菌(*** C/Salmonella paratyphi C)和猪霍乱沙门氏菌(***/Salmonella Choleraesuis)的方法。根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌序列,分别设计引物和Taqman探针,使用168株不同血清型的沙门氏菌和21株变形杆菌等非沙门氏菌进行实时荧光PCR检测的特异性试验,可以实现特异性检测丙型副伤寒沙门氏菌,并且可以同时检测丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌。经模拟污染样品检测,灵敏度可达到2～5 cfu/mL的添加浓度。该方法可以快速检测食品中丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌。

摘要：根据鼠伤寒沙门氏菌的特异序列,分别设计扩增引物和测序引物,建立焦磷酸测序检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。针对鼠伤寒沙门氏菌设计特异性扩增引物,对目标片段进行PCR扩增,然后制备单链模板,并利用测序引物进行焦磷酸测序。测序结果表明,6株不同来源的鼠伤寒沙门氏菌均可以扩增出碱基序列为TACAACCGGA GTGCACATTA ATCCCGCAGC的基因片段,而30株阴性对照菌株均未得到扩增。进行BLAST比对表明,该序列与GenBank中鼠伤寒沙门氏菌的碱基序列100%匹配。焦磷酸测序法是一种快速、准确的检测方法,可用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。

摘要：目的建立基于TaqMan探针三重荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)方法。方法根据nuc(GenBank:EF529607.1)、mecA(GenBank:JN108029.1)和femA gene(GenBank:DQ352463.1)基因序列,分别设计特异性引物和Taqman探针,nuc探针5、端标记TET、mecA探针5、端标记HEX、femA探针5、端标记FAM,建立基于Taqman探针三重荧光PCR检测MRSA的方法,并对69株金黄色葡萄球菌分离株进行基因检测与耐药表型比较。结果 MRSA出现femA、mecA、nuc基因扩增曲线,而表皮葡萄球菌等14株对照菌株扩增结果呈阴性;femA、mecA、nuc基因的扩增效率分别为104%、90.3%、98%,线性系数R2分别为0.999、0.994、0.998;69株分离株中femA、nuc基因阳性率为100%,mecA基因阳性率为13.04%,mecA与耐甲氧西林表型符合率为100%。结论建立的方法特异性强、准确,为金黄色葡萄球菌鉴定和耐药基因分析提供参考依据。