摘要：目的构建过表达人类白细胞抗原G5(HLA-G5)慢病毒载体,筛选建立稳定表达HLA-G5的JAR稳转细胞株。方法根据HLA-G5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片段。将目的基因定向接入经BamHI/AgeI酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒GV492-HLA-G5。筛选阳性克隆和测序鉴定后,使用三质粒包装系统将含有目的基因的重组质粒GV492-HLA-G5和辅助包装质粒共转染至293T细胞进行病毒包装及纯化并测定病毒滴度。设置过表达实验(OE)组和阴性对照(NC)组,在感染复数为20的条件下感染JAR细胞。用荧光显微镜观察各组绿色荧光蛋白的表达情况。用浓度为2μg·mL^(-1)嘌呤霉素筛选出稳定表达HLA-G5的JAR细胞株。用qRT-PCR和Western blot法检测JAR细胞中HLA-G5的mRNA和蛋白表达水平。结果经PCR及测序鉴定证明,序列与设计序列一致,成功构建重组慢病毒载体。病毒滴度结果显示,OE组的滴度为2×108TU·mL^(-1),NC组的滴度为4×108TU·mL^(-1)。qRT-PCR显示OE组JAR细胞中HLA-G5的mRNA(108.69±4.25)表达水平较NC组(1.00±0.76)明显增高(P<0.01)。Western blot显示OE组JAR细胞中HLA-G5的蛋白(65.84±14.11)表达水平较NC组(1.35±0.37)明显升高(P<0.01)。结论成功构建HLA-G5慢病毒载体并筛选建立JAR-HLA-G5稳转细胞株。

摘要：背景:雌二醇能否改变骨髓基质细胞分化过程中过氧化物酶增殖活化受体γ2-mRNA的表达进而影响其向成骨细胞分化有待研究。目的:观察骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的介质中,17β-雌二醇对其过氧化物酶增殖活化受体γ2mRNA及蛋白表达的影响。设计:对比观察实验。单位:成都军区总医院中心实验室,德阳市人民医院检验科,成都百奥生物技术有限公司。材料:选用1只雌性SD大鼠,3月龄,清洁级,体质量(200±20)g,由成都中医药大学实验动物研究中心提供(动物许可证号码11)。DMEM培养液购自Hyclone,1,25一双羟维生素D3、地塞米松和雌二醇购自Sigma公司,引物用Jellyfish软件设计,由大连宝生物技术有限公司合成。RT-PCR试剂盒和RNA提取试剂盒均由大连宝生物提供。兔抗山羊多抗(北京中山生物技术有限公司),山羊抗鼠PPARγ2抗体和Western Blotting增强化学发光试剂均购自Santa Cruz公司。方法:实验于2001-04/2002-07在成都军区总医院中心实验室和成都百奥生物技术有限公司完成。①无菌条件下分离大鼠骨髓基质细胞,1,25一双羟维生素D3和地塞米松诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化,观察细胞生长情况。②用0,0.1,10和1000nmol/L不同浓度雌二醇对细胞分化过程进行干预3d。培养细胞用Tris-Triton X-100缓冲液加超声粉碎裂解细胞,在Beckman CX-7生化分析仪上测定碱性磷酸酶的活性,观察不同浓度雌二醇条件下细胞产生碱性磷酸酶的情况。③100g/L中性甲醛固定培养于24孔板的骨髓基质细胞,Weigert苏木素染液染色10min,自来水冲洗,5g/L盐酸乙醇分化,Van Gieson染色,体积分数为0.95乙醇分化脱水,二甲苯透明,显微镜下观察并照相,观察细胞胶原合成情况。④应用半定量RT-PCR及Northern blot、Western blot技术,观察不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中PPAR-γ2mRNA及蛋白表达的影响。主要观察指标:①骨髓基质细胞生长情况、细胞胶原合成情况。②不同浓度雌二醇条件下细胞产生碱性磷酸酶的情况。③不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中PPAR-γ2mRNA及蛋白表达的影响。结果:①骨髓基质细胞接种后4h开始贴壁,24～72h可见贴壁细胞明显增大且分裂增殖,细胞呈三角形,多角形或梭形。3d后首次换液,贴壁细胞体积增大,呈集落生长,10d左右融合成遍。多次传代的骨髓基质细胞呈有序的成纤维细胞样分布。②随着雌二醇浓度的增加,胞浆染色越淡,由鲜红、淡红到黄色。胞浆呈红色说明有胶原合成,红色越深,表明胶原越多。③不同浓度雌二醇条件下细胞均能产生碱性磷酸酶,其活性随雌二醇浓度增加而降低,雌二醇浓度从0nmol/L增加到1000nmol/L时,碱性磷酸酶从(710.1±41.7)nkat/g降至(60.0±11.7)nkat/g(t=29.0,P<0.01)。④雌二醇浓度为0.1,10和1000nmol/L时,PPAR-γ2mRNA的表达量均明显高于雌二醇0mol/L组(t=6.1,7.2,11.5,P<0.01),Northern blot结果显示雌二醇浓度为0.1,10和1000nmol/L时PPAR-γ2mRNA表达量分别为(4.0±0.4)%,(1.7±0.2)%,(2.8±0.2)%,明显高于雌二醇0mol/L组[(1.5±0.1)%,t=5.4,105.0,14.2,P<0.01]。⑤Western Blot检测结果显示雌二醇能明显增加骨髓基质细胞PPAR-γ2蛋白的表达。雌二醇浓度为0.1,10和1000nmol/L时,PPAR-γ2蛋白的表达量分别为(2.2±0.2)%,(2.6±0.2)%,(4.1±0.2)%,明显高于雌二醇0mol/L组[(1.2±0.10)%,t=6.6,8.5,13.2,P<0.01]。结论:雌二醇能明显抑制体外培养的骨髓基质细胞碱性磷酸酶的表达,同时促进骨髓基质细胞内过氧化物酶增殖活化受体γ2mRNA和蛋白的表达。

摘要：背景绝经后骨质疏松的病理生理机制尚未完全阐明,研究表明骨丢失与雌激素缺乏相关,后者可导致多种细胞因子生成增加,继而引起成骨细胞和破骨细胞生成增多,骨吸收增强。雌二醇能否改变骨髓基质细胞分化过程中Cbfα1和PPAR-γ2mRNA的表达进而影响其向成骨细胞分化尚不清楚。目的研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的介质中,17β-雌二醇对其核结合因子α1(Cbfα1)及过氧化物酶增殖活化受体γ2(PPAR-γ2)mRNA表达的影响,探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用。设计非随机对照研究。地点和对象所有实验均在成都军区总医院检验科和成都百奥生物技术有限公司完成,分离骨髓基质细胞所需大鼠由成都中医药大学实验动物研究中心提供。干预1,25(OH)2D3和地塞米松诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化,用不同浓度[(0～1)×10-6mol/L]雌二醇对细胞分化过程进行干预。主要观察指标应用半定量RT-PCR及Northernblot技术,观察不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中Cbfα1及PPAR-γ2mRNA表达的影响。结果雌二醇能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中Cbfα1mRNA的表达,雌二醇浓度为[(0～1)×10-6mol/L]时,Cbfα1mRNA的表达量从(25.0±3.3)%降至(19.8±2.2)%(t=2.62,P<0.05),(14.5±1.3)%(t=5.92,P<0.01)和(6.5±1.9)%(t=9.72,P<0.01);

摘要：目的探讨体外合成的小干扰RNA(siRNA)对人树突状细胞(DC)共刺激分子CD80和CD86基因表达的影响。方法设计并合成了3条siRNA(siRNA1、siRNA2和siRNAc),在脂质体的介导下转染树突状细胞,于转染后24、48、72h收集细胞,用半定量RT-PCR检测CD80和CD86 mRNA的变化,用蛋白印迹检测CD80、CD86蛋白的表达。结果转染24、48、72h后,DC CD80 mRNA均有明显减少(P0.05)。Western Blot结果显示转染48、72h后,siRNA1对CD80蛋白表达的抑制率为(67.3±4.80)%和(80.9±5.23)%;siRNA2后对CD86蛋白表达的抑制率为(60.7±4.15)%和(74.7±4.63)%。结论 siRNA可特异抑制树突细胞B7基因的转录和表达,为进一步研究siRNA诱导移植免疫耐受提供了理论和实验基础,为诱导器官移植免疫耐受提供了新思路和途径。

摘要：目的探讨体外合成的B7特异性小干扰RNA(siRNA)对树突状细胞(DC)功能的影响。方法设计并合成B7特异性siRNA,在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测B7-1、B7-2蛋白的表达,用ELISPOT检测DC与淋巴细胞共培养后T细胞分泌IFN-γ,用MTT法检测混合淋巴细胞增殖反应和CTL特异性杀伤率。结果Western Blot结果显示转染72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为(80.9±5.23)%;siR-NA2对B7-2蛋白表达的抑制率为(74.7±4.63)%。经转染B7-1、B7-2分子特异性siRNA的DC激活后,T淋巴细胞分泌IFN-γ分别为(84.6±23.1)103U/L和(76.7±19.7)10.3U/L明显低于对照组(204.5±46.2)103U/L;各组DC刺激淋巴细胞增殖指数(PI)分别为1.73±0.32和1.53±0.25,也低于对照组4.23±0.74。CTL杀伤实验结果表明:对照组的特异性杀伤率为(76.4±7.6)%,siRNA1和siRNA2组的特异性杀伤率分别为(14.4±3.6)%和(18.6±4.7)%,低于对照组。结论B7特异性siRNA可明显抑制树突细胞B7基因的表达,并可降低DC激活T淋巴细胞增殖和CTL的细胞毒性,为进一步研究siRNA诱导免疫耐受和治疗自身免疫性疾病提供了新思路和方法。

摘要：目的探讨体外合成的小于扰RNA(siRNA)对人树突状细胞(DC)共刺激分子B7基因表达的影响。方法设计并合成了3条siPRNA(siRNA1,siRNA2和siRNAc),在脂质体的介导下转染树突状细胞,于转染后24、48、72h收集细胞,用半定量RT-PCR检测B7-1和B7-2mRNA的变化,用蛋白印迹检测B7-1、B7-2蛋白的表达。结果:转染24、48、72h后,DC B7-1 mRNA均有明显减少(P0.05)。WestemBlot结果显示转染48、72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为(67.3±4.80)%和(80.9±5.23)%;siRNA2后对B7-2蛋白表达的抑制率为(60.7±4.15)%和(74.7±4.63)%。结论siRNA可特异抑制树突细胞B7基因的转录和表达,为进一步研究siRNA诱导移植免疫耐受提供了理论和实验基础,为诱导器官移植免疫耐受提供了新思路和途径。

摘要：目的探讨RNA干扰技术阻断B7/CD28共刺激信号对小鼠异体皮肤移植排斥反应的影响。方法设计并合成B7特异性siRNA,在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测B7-1、B7-2蛋白的表达。在小鼠异体皮肤移植前7d,经静脉将转染B7特异性siRNA的DC输入小鼠体内(DC转染组),同时设立同种异体移植对照组、同系移植对照组、环孢素A(CsA)治疗组(术后每日皮下注射CsA5 mg/kg)和未转染DC组(移植前输注未转染DC),观察各组移植皮瓣的存活时间和排斥反应情况,并用MTT法检测混合淋巴细胞增殖反应,术后1个月观察迟发性超敏反应情况。结果Western Blot结果显示转染72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为(77.2±6.26)%;siRNA2对B7-2蛋白表达的抑制率为(73.3±5.42)%。与同种异体移植对照组和未转染DC组比较,DC转染组移植皮瓣成活时间明显延长(P<0.01),组织排斥反应程度较轻,混合淋巴细胞反应和DTH反应显著降低(P<0.01)。结论B7特异性siRNA可明显抑制树突细胞B7基因的表达,以阻断B7/CD28共刺激通路,抑制小鼠皮肤移植排斥反应,为进一步研究siRNA诱导免疫耐受提供了新方法。