摘要：为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P<0.01),蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低.RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达,荧光素酶活性分析表明,干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍(n=3,P<0.01).上述结果表明,成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.

摘要：背景:表皮干细胞对于修复皮肤缺损具有重要意义,但如何方便、快捷地对所获取的表皮干细胞进行纯化培养一直没有比较好的技术方法。目的:拟应用胰蛋白酶差速脱壁法去除表皮干细胞中混杂的成纤维细胞。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-06在解放军军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室完成。材料:实验所用皮肤来源于20～30岁女性乳房缩小整形术患者,由北京协和医院整形外科提供。方法:无菌条件下切取皮肤,剪除皮下脂肪组织,采用胶原酶/Dispase酶和胰蛋白酶两步法体外分离培养表皮干细胞。待细胞生长达70%～80%融合时,加入胰蛋白酶消化尚未脱壁的细胞,30s～1min后吸出脱壁细胞,同法传代培养至第5代细胞。主要观察指标:第1,5代表皮干细胞表面标志CD29、CD49f、CD71的表达。流式细胞仪检测第5代细胞生长周期。免疫荧光检测第5代表皮干细胞和传代时胰蛋白酶消化30s～1min即脱壁细胞角蛋白19及波形蛋白的表达。透射电镜观察表皮干细胞超微结构。结果:第1代表皮干细胞CD29阳性率94.32%,CD49f阳性率86.24%,CD71呈弱阳性,经过4次胰蛋白酶差速脱壁去除混杂细胞后,第5代表皮干细胞CD29阳性率96.77%,CD49f阳性率96.31,CD71呈弱阳性,82.58%表皮干细胞处于G0～G1期。第5代表皮干细胞角蛋白19呈阳性,波形蛋白呈阴性,而传代时胰蛋白酶消化脱壁的细胞角蛋白19呈阴性,波形蛋白呈阳性,证实为成纤维细胞。表皮干细胞呈克隆样生长,透射电镜下胞质中可见呈束状排列的角蛋白丝。结论:应用胰蛋白酶差速脱壁法能够简单、有效地获取纯化的表皮干细胞。

摘要：背景:孕中期羊水干细胞的分离培养及生物学性状研究已取得了一定进展,但孕足月羊水是否也可作为干细胞来源目前报道不多。目的:探讨从孕足月羊水中分离培养羊水干细胞的可行性。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-10/2008-08在解放军总医院妇产科及解放军军事医学科学院干细胞及再生医学研究室完成。材料:孕足月羊水来自在解放军总医院行剖宫产、排除胎儿畸形及母体全身性疾病的孕妇,告知后同意留取羊水标本10例;鼠龄2个月雄性BALB/C裸鼠,体质量15～20g,用于致瘤实验的观察。方法:从10例孕晚期(孕38～40周)羊水中分离扩增羊水干细胞进行传代培养,取第5,10代对数生长期的细胞在酶标仪450nm波长处检测吸光度(A)值,绘制羊水干细胞生长曲线;待细胞70%汇合时换为脂肪诱导培养基用于检测体外分化能力;分别于第4代,第11代行染色体核型分析;取第4～6代羊水干细胞1×107个注射到BALB/C裸鼠皮下,观察8周。主要观察指标:①羊水干细胞的形态学特点及生长曲线。②流式细胞仪及免疫荧光法检测羊水干细胞表面标志的表达。③体外向脂肪细胞分化的能力。④染色体核型及致瘤实验结果。结果:10例孕晚期羊水中有4例分离到梭形可持续传代的细胞群,细胞增殖旺盛;羊水干细胞原代生长较慢,传代后生长迅速,第5代,第10代细胞的生长曲线形态相似;流式细胞仪检测证实孕足月羊水干细胞表达CD44,CD29,CD105等间质来源标志,免疫荧光检测显示表达胚胎来源标志SSEA-4及oct-4;换为脂肪诱导培养基后6d,细胞内出现透明、浑圆的小液滴,表明向脂肪样细胞分化;所有标本的染色体核型均为46XX或46XY,第11代染色体核型保持正常;羊水干细胞注射到裸鼠体内后无肿瘤形成。结论:孕晚期羊水也可分离培养到干细胞,可以作为干细胞的新来源。

摘要：目的构建沉默信息调节因子(silent information regulaor,Sir)样蛋白1(Sirtuin 1,SIRT1)的特异性短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,获得敲低SIRT1的肝癌细胞系,以探讨其对肝癌细胞的增殖和耐药敏感性的作用。方法设计针对SIRT1靶点特异性的干涉序列,连接到经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切的pSicoR-GFP载体,慢病毒包装293T产生病毒,感染肝癌细胞,建立肝癌细胞SIRT1低表达的稳定株。利用实时定量PCR检测SIRT1的干涉效果;通过平板克隆形成实验、CCK8细胞增殖实验检测SIRT1被干涉后对肝癌细胞增殖能力的影响;通过细胞耐药敏感性实验及实时定量PCR检测耐药基因的表达,考察SIRT1干涉对肝癌细胞耐药敏感性的影响。结果实时定量PCR实验证明该慢病毒干涉载体能显著抑制肝癌细胞中SIRT1的表达,SIRT1干涉可抑制肝癌细胞的增殖能力,下调耐药基因的表达,增强肝癌细胞的药物敏感性。结论 SIRT1抑制肝癌细胞耐药性。