摘要：在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成899bp的MluⅠ基因和1 312bp的***Ⅰ基因.并将合成的MluⅠ基因连接到表达载体pet30a上,重组表达载体构成pet30a-MluⅠ,将***Ⅰ基因连接到表达载体PUC19上,重组表达载体构成***Ⅰ.测序结果显示,载体构建成功后利用体外重组转化技术,将pet30a-MluⅠ和***Ⅰ转入T7expression ***表达菌株中.重组工程菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE鉴定,发现限制性内切酶MluⅠ成功表达.该酶的成功表达不仅为后续研究提供了材料,而且为实验室制备限制性内切酶在方法上开辟了新的途径,为更多新发现的内切酶基因的成功克隆提供了参考.

摘要：为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑,PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞,48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在106 TU·mL-1之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。

摘要：在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成编码青霉素结合蛋白的基因PBP 2b。将合成的PBP 2b基因连接到载体pet-30a上,并将重组表达载体(pet-30a)/PBP2b-tiger转入T7 expression ***表达菌株中。重组工程菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE鉴定,发现青霉素结合蛋白(PBPs)成功表达。本研究构建了高表达青霉素结合蛋白(PBPs)的原核表达系统,制备出青霉素结合蛋白,从而为进一步从基因水平认识青霉素结合蛋白(PBPs)奠定基础,为了解细菌耐药的机制提供依据。

摘要：基因工程技术作为现代生物技术的核心,能够为基因的结构和功能研究奠定基础。以生物类专业的专业核心课程基因工程技术为例,阐述课程思政教学整体设计思路及育人目标,从修订教学目标、丰富教学内容、创新教学方法、完善教学评价多个方面提出对策,为生物医药类相关课程的课程思政教学设计与实施提供参考。

摘要：【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT108002-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。

摘要：【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。

摘要：[目的]研究载体量和感受态对阳性克隆率的影响。[方法]利用引物拼接PCR技术,自行设计26条引物合成一个835 bp的目的基因,将该基因与约20 kb的大分子载体连接构成重组质粒。在1 500 ng目的基因底物量的基础上,设置50、100、150、200、250、300 ng 6个梯度载体量,得到的重组反应产物再转化入Top10F'、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6种不同的感受态中,组成36个试验组合。[结果]不同载体量阳性克隆率由大到小依次为200、250、300、150、100、50 ng,200 ng的阳性克隆率最高可达75%,平均达28.5%。不同感受态细胞阳性克隆率由大到小依次为Stbl3、Top10F'、DH5α、JM108、Epi400、SCSI,Stbl3在任何载体浓度下均高于其他感受态,平均阳性克隆率为42.4%。[结论]载体量和感受态均明显影响阳性克隆率,最佳组合为200 ng的载体分子量配合Stbl3感受态,阳性克隆率可达75%。

摘要：Stbl2^(TM)菌株适合克隆不稳定的外源DNA片段,但该菌株易受噬菌体侵染,且在构建某些高拷贝质粒时,难以克隆成功。利用CRISPR/Cas9技术将Stbl2^(TM)菌株的抗噬菌体相关基因fhuA和控制拷贝数的基因pcnB进行编辑,降低克隆难度,提高克隆效率。针对2个基因分别设计sgRNA,构建含有sgRNA的质粒pTarget-fhuA和pTarget-pcnB,分别将2个质粒与pCas9-Red质粒转入Stbl2^(TM)菌株中,经菌落PCR和测序验证基因正确编辑后再将2个外源质粒消除,并将2 kb的线粒体基因组序列作为外源基因,转入菌株进行最终的功能验证。结果表明:fhuA基因被成功敲除103 bp,pcnB基因被成功敲除802 bp,将高拷贝pUC57质粒转入基因编辑后的Stbl2^(TM)菌株,可明显降低质粒的拷贝数,且能正确克隆线粒体基因难度序列。该研究构建的菌株可作为后续克隆难度序列的感受态使用,还可为难度序列的基因克隆提供借鉴方法。

摘要：从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列,利用密码子优化软件(Codon Optimization)进行序列优化,设计并合成24条首尾重叠的引物合成786bp的DNaseⅠ基因,构建重组载体pET30a-DNaseⅠ,转入BL21(DE3),ArcticExpress(DE3),BL21(DE3)pLysS 3种感受态中诱导表达后,纯化目的蛋白并验证其活性.结果表明:BL21(DE3),ArcticExpress(DE3)两种感受态菌落生长异常,且未纯化到目的蛋白,BL21(DE3)pLysS感受态菌落生长正常,但未经诱导和葡萄糖诱导表达的菌液中也未纯化到目的蛋白,IPTG诱导扩大培养的菌液中纯化到0.15 mg/mL的目的蛋白.经验证,酶原液能彻底消化λ-DNA和不同大小的质粒DNA,酶稀释液消化产物电泳检测显示条带拖尾弥散,表明酶稀释液只能消化部分λ-DNA.

摘要：文章基于校企协同深入合作之大趋势,围绕职业教育与产业、行业对接的需求,以已有的国家级工程协同创新中心和区域生物医药公共实训基地为支撑,联合省级产教融合型试点企业共建生物医药产业学院,共同开展“基因工程技术”课程改革,通过介绍在课程设计、教学实施、学业评价等方面的具体做法,以期为地方院校相课程改革提供参考,切实提高区域人才培养质量。