摘要：为了解近年广西地区猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)基因组特征和分子遗传多样性,本研究设计11对特异性引物,对中国广西南宁猪腹泻病例中检测到的1株PEDV GXNN进行了全基因组测定,同时进行相似性比对、遗传进化、基因变异及S基因重组分析。结果显示,广西变异株GXNN与其他PEDV分离株具有相似的基因组特征,基因组全长28035 bp,与不同参考株核苷酸相似性为96.4%~98.7%,S、ORF3、M和N基因核苷酸相似性分别为93.7%~98.9%、90.9%~99.4%、97.4%~99.7%和95.6%~99.2%;氨基酸相似性分别为92.9%~99.5%、91.3%~99.1%、97.4%~99.1%和96.4%~99.5%。GXNN与近年国内大多数分离株亲缘关系较近,处于同一分支,为GII-b亚型,而与经典疫苗毒株、国内早期流行株、国外流行株及广西CH-GX-2015-750A分离株亲缘关系都较远,为不同亚型。与目前常用5个疫苗毒株相比,S基因变异较大,在118、844和905位插入氨基酸Q,在COE(Core neutralizing epitope)区和主要抗原表位区发生4个独特的氨基酸位点突变,其他区域发生14个位点突变;ORF3、M和N基因分别在126位、4D4区和PN-D4区发生126 T/A、199 A/V和103 T/A突变。重组分析发现在S基因的高变区826~3142 nt存在1个潜在的重组区域。本研究成功获得1株PEDV全基因组序列,对其进行遗传变异分析,为PEDV分子流行病学研究和新型疫苗研发提供参考依据。

摘要：[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。

摘要：为建立一种快速检测阿卡斑病毒(AKAV)的分子生物学检测方法,本研究通过比较分析AKAV基因组序列,在S基因保守序列区域设计重组酶介导等温扩增(RAA)引物及探针,筛选最佳引物对,然后对RAA反应温度、引物浓度以及探针浓度进行优化,建立了AKAV的荧光逆转录重组酶介导的核酸等温扩增(RT-RAA)快速检测方法。结果显示,所建立的荧光RT-RAA方法在42℃反应20 min即可快速检测出AKAV,检测下限可达6.26×10^(1)copies/μL,与牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等无交叉反应,并具有良好的重复性。对37份临床样品进行检测,阳性检出率为43.24%,与RT-qPCR检测结果符合率为94.59%。结果表明,建立的AKAV荧光RT-RAA快速检测方法具有快速、特异、灵敏、稳定等特点,可为AKAV的现场快速检测提供可靠方法。