摘要：为探究活化转录因子4(ATF4)在内质网应激(ERS)诱导剂衣霉素(Tm)诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡中的作用及其分子机制,设计ATF4CDS区的shRNA片段,并将合成片段连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,构建pCD513BshATF4慢病毒干扰载体;对重组载体进行慢病毒包装并感染小鼠卵巢颗粒细胞;感染后的细胞经Tm处理后,通过流式细胞术、qRT-PCR和Western blot方法检测ATF4在Tm诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡中的作用。结果表明:成功构建了pCD513B-shATF4慢病毒载体并成功包装慢病毒;ATF4慢病毒高效感染小鼠卵巢颗粒细胞,且具有显著抑制ATF4表达作用;抑制ATF4显著下调CHOP、ERO1α和Caspase-3蛋白表达,并降低Tm诱导的卵巢颗粒细胞凋亡,推测ATF4可能通过调控ATF4-CHOP-ERO1α-Caspase-3信号促进Tm诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡。

摘要：针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10^7 TU/mL^10×10^7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%~90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。