摘要：根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的CS中和表位区(499~789 aa)序列设计1对特异性引物,在其5′端分别引入BamHⅠ和HindⅢ,PCR扩增PEDV CS区。将扩增的CS片段插入至pBApo-EF1α_Pur_DNA真核表达载体的BamHⅠ和HindⅢ位点,然后扩增含CS区表达盒,将其插入至含猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)AD基因的PRV转移质粒pG-AD-EGFP中,构建转移质粒pG-AD-CS-EGFP。利用转染试剂ZLip2000将伪狂犬病病毒(PRV)三基因缺失毒株rPRV NY-gE-/gI-/TK-基因组与转移质粒pG-AD-CS-EGFP共转染ST细胞,获得携带有TGEV AD、PEDV CS区和绿色荧光蛋白标记基因的重组病毒rPRV-AD-CS-EGFP。扩增重组病毒rPRV-AD-CS的表达盒,测序后进行遗传稳定性评价,同时将重组病毒rPRV-AD-CS、亲本株Bartha-K61和PRV强毒株分别接种小鼠,进行安全性评价。将该重组病毒与CRISPR/Cas9-EGFP敲除质粒共转染ST细胞,经3轮病毒空斑纯化获得无绿色荧光标记的重组病毒rPRV-AD-CS。经Western blot和IFA证实rPRV-AD-CS在ST细胞中能表达CS外源蛋白,具有良好的遗传稳定性和安全性。结果表明,成功构建共表达TGEV AD蛋白和PEDV S蛋白CS区的重组病毒株rPRV-AD-CS,该重组病毒具有遗传稳定性和安全性,为开发安全、有效的预防TGEV、PEDV和PRV感染的三联苗奠定基础。

摘要：参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。

摘要：介绍了天津国家会展中心项目结构总体设计思路、各结构单体结构体系、执行的设计标准和设计关键点。本项目建筑功能多样、建筑造型新颖独特,涉及混凝土、钢结构、组合结构等多种结构类型.结构形式复杂多样。