摘要：旨在建立一种针对狂犬病病毒SAD L16株单质粒拯救的反向遗传操作系统。根据全长cDNA感染性克隆pSAD-L16 N、P和L基因上游序列的不同,分别设计多对引物将EMCVIRES序列、PV IRES序列和TaV 2A序列分别克隆入pSAD-L16载体的相应位置中,构建成5个重组狂犬病病毒全长cDNA克隆。在无需辅助质粒的情况下直接转染BSR T7/5细胞拯救病毒,并对拯救病毒进行生物学特性的鉴定和分析。结果表明,只有pSADNeNePeL和pSAD-NeNtPeL能够成功拯救出重组狂犬病病毒,获救病毒均高度致弱且增殖缓慢。获救的2株重组狂犬病病毒具有不同的遗传稳定性,表现出与野生型亲本毒株较大的差异。本研究首次建立起一种针对狂犬病病毒的单质粒拯救系统,为深入研究狂犬病病毒基因组结构与功能、分子致病机制以及狂犬病病毒与宿主相互作用等提供了一个基础的技术平台。

摘要：目的在我国狂犬病均由基因1型狂犬病病毒(rabies virus,RV)引起。本研究针对RV N基因保守序列设计并合成了一套简并引物和Taqman探针,在优化反应条件的基础上,建立了检测RV核酸的一步法荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法。方法与结果该方法能特异检测基因1型,不能检测基因2-7型和犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病病毒(CAV)、水泡性口炎病毒(VSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)等5种非狂犬病病原体,其检测灵敏度可达到4.68个TCID50的病毒含量。用该方法对29份新鲜和5份腐败的临床犬脑组织样品进行检测,并与国际金标准确诊方法狂犬病荧光抗体染色法(FAT)和乳鼠脑内接种试验(MIT)及本实验室建立的套式RT-PCR方法进行比较。结果表明所建立的qRT-PCR与套式RT-PCR的符合率为100%,二者均检测出12份阳性的新鲜样品和5份阳性的腐败样品,而FAT只检测出12份阳性的新鲜样品和1份阳性的腐败样品,MIT只检测出12份阳性,未检测出阳性腐败样品。检测中FAT和MIT确诊的所有阳性样品在qRT-PCR检测均是阳性,而在FAT检测为阴性的4份腐败样品在qRT-PCR为阳性,说明所建立的qRT-PCR方法准确性达到了FAT和MIT的水平,而且灵敏度更高,更适合于腐败样品的检测。结论研究结果表明该qRT-PCR方法特异性好、灵敏度高、污染率低、操作简单,在我国动物狂犬病临床诊断上具有巨大的应用价值。