摘要：【目的】阐明蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线分子机制,构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。【方法】克隆杀线蛋白酶编码基因atpA与clpX,利用基因工程手段对杀线蛋白酶编码基因进行PCR扩增,并与载体pET-21b连接构建重组载体,提取重组质粒转入蛋白表达载体大肠杆菌BL21(DE3)。利用菌落PCR和测序验证转化效果。加入IPTG诱导蛋白表达,使用Ni-NTA柱进行重组蛋白的纯化,利用SDS-PAGE与Western blot验证ATP-α与ClpX纯化效果并进行杀线活性测定。【结果】菌落PCR验证和测序表明,重组载体中含有蛋白酶编码基因atpA与clpX,且基因序列与参考序列一致,证明目的基因已经成功插入BL21(DE3)表达载体中。SDSPAGE与Western blot验证表明,重组蛋白得到正确诱导与纯化,成功构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。杀线活性测定结果表明ATP-α与ClpX均具有较强的杀线效果。ATP-α在72 h达到66.75%的杀线率,ClpX在72 h达到75.46%的杀线率。同时,两个蛋白酶共同作用杀线能力显著增强,24 h便达到66.32%的杀线率,72 h杀线率达到91.01%。【结论】ATP-α与ClpX经原核表达及纯化后具有较高的杀线活性,且两者共同处理松材线虫,杀线效果更强,证明蛋白酶ATP-α与ClpX是重要的杀线因子,为设计和筛选杀线药物提供了新的线索和依据。

摘要：将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5'-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3'),反向引物为M05R1(5'-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3'),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行检测。结果表明:引物组合对所有81份松材线虫株系均扩增出一条600bp的清晰、明亮的条带,而对8份拟松材线虫、1份霍夫曼尼伞滑刃线虫、1份大核滑刃线虫、1份长尾属线虫均无扩增产物。该对引物可以检测单条松材线虫。利用这对特异引物组合可构建松材线虫检测试剂盒,实现对松材线虫的快速检测的目标。

摘要：为了进一步开发蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus NJSZ-13菌株对松材线虫病的生物防治潜能,提高该菌的利用率,为后期蜡样芽孢杆菌NJSZ-13粉剂的工艺生产做准备,本研究通过单因素和正交试验对该菌株进行了发酵培养基和摇瓶发酵条件的优化。培养基优化单因素试验结果显示,培养基最佳碳源为可溶性淀粉,最佳氮源为大豆蛋白胨,最佳无机盐为CaCl2;将可溶性淀粉、大豆蛋白胨和CaCl2(C)三因素按L9(33)设计正交试验,结果表明,最佳配比为:可溶性淀粉10 g·L^-1,大豆蛋白胨14 g·L^-1,CaCl26 g·L^-1。发酵条件优化结果表明,最佳发酵温度为28℃;最佳发酵初始pH值为7.5;最佳接种量为2%;最佳装液量为30%。与优化前的培养条件相比,在该优化条件下,摇瓶发酵单位体积发酵液中的菌株活菌数量达到4.10×10^9 cfu·mL^-1,是优化前单位体积发酵液中活菌数量的4.1倍,达到了菌体富集的目的。