摘要：为建立Taura综合征病毒(Taura syndrome virus,简称TSV)的TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PC方法,根据TSV衣壳蛋白基因保守序列设计引物和TaqMan-MGB探针,扩增产物长度为118bp。将PCR产物克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选鉴定、SalⅠ单酶切,得到线性化转录模板DNA,经体外转录获得标准品RNA。以体外转录的RNA作为模板,进行一步法荧光定量RT-PCR反应,根据RNA模板拷贝数与Ct(Cycle threshold,Ct)值制备了标准曲线,制作的标准曲线在2×101拷贝/μL≤TSV RNA≤2×107拷贝/μL的范围内具良好的线性关系,可以用于TSV的定量分析,检测灵敏度为20个拷贝数。特异性、重复性试验结果表明,该方法对SPF对虾组织RNA没有扩增反应,表现出良好的特异性;组内和组间实验变异系数分别为0.32%～1.84%和0.79%～2.71%。利用TaqMan-MGB探针建立检测TSV的一步法荧光定量RT-PCR方法可用于对虾TSV的检测。

摘要：【目的】建立能同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR,为水产品质量安全检测工作提供技术支持。【方法】以LB肉汤培养基为共增菌培养基,根据沙门氏菌inv A基因、大肠杆菌O157∶H7 rfb E基因、志贺氏菌ipa H基因和金黄色葡萄球菌fem A基因的保守序列设计引物,对引物浓度配比、退火温度及反应体系等进行优化,并对建立的多重PCR进行特异性、敏感性及临床样品检验试验。【结果】4种目标致病菌在LB肉汤培养基中36℃培养18 h后,均表现出良好的生长趋势,增菌数量级均在108 CFU/m L以上。优化后的多重PCR能对4种目标菌的单一或混合基因组DNA进行特异性扩增,而对单增李斯特氏菌、肺炎克雷伯菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等其他菌株的基因组DNA均未扩增出任何条带;对沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7和金黄色葡萄球菌的最低检出限为102 CFU/m L,对志贺氏菌最低检出限为10 CFU/m L。应用该多重PCR对56份水产品进行检测,其结果与按照GB/T 4789-2003、GB/T 4789-2010检测的结果一致。【结论】针对同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR具有快速、便捷、灵敏、准确等优点,可为水产品食源性致病菌检测及其安全控制行业提供一种快速、准确、高效、经济的检测手段。

摘要：【目的】针对凡纳滨对虾白便病的危害现状,克隆其WAP基因并分析其组织表达特性及抗病功能,为凡纳滨对虾抗病药物开发提供参考依据。【方法】设计WAP基因特异性引物,用RT-PCR检测WAP基因在凡纳滨对虾血细胞、眼柄、鳃、肝胰腺、心脏、胃、肌肉、神经、肠、后盲囊和表皮等11种组织的表达分布情况;采用实时荧光定量PCR检测患白便病凡纳滨对虾鳃和肠道组织的WAP基因表达量;重组表达WAP蛋白,使用ELISA分析其与细菌多糖LPS(脂多糖)、PGN(肽聚糖)和LTA(脂磷壁酸)的结合能力。【结果】WAP基因在11个凡纳滨对虾组织均有表达,其中,以在血细胞中的表达量最高,在表皮、眼柄和肝胰腺的表达量表达较低;WAP基因在感染白便病凡纳滨对虾鳃和肠道组织的表达量显著高于健康凡纳滨对虾(PLPS>LTA。【结论】WAP基因与凡纳滨对虾抗病免疫功能密切相关,WAP融合蛋白在开发凡纳滨对虾抗白便病药物方面具有潜在应用价值。

摘要：目的建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的四重PCR方法。方法根据致病性嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶(ahpA)基因、气溶素(aerA)基因和溶血素(hlyA)基因的保守序列以及嗜水气单胞菌的16SrRNA基因种属特异性序列分别设计4对特异性引物,通过优化各引物浓度、退火温度和Mg2+浓度,确定了四重PCR的最佳反应条件;然后进行特异性和敏感性试验,并比较其与常规微生物学方法对不同菌株和临床样本的检出率。结果该方法特异性好,能特异性检测并鉴别出嗜水气单胞菌致病性菌株;检测灵敏度高,最低可检测到约100fg的嗜水气单胞菌基因组DNA;对9株嗜水气单胞菌的检测结果与常规微生物学方法一致,对56份送检的水产动物样品的检出率为21.4%,高于常规微生物学方法的16.1%,两者检测结果符合率为94.6%。结论成功建立了能同时检测嗜水气单胞菌16SrRNA、aerA、ahpA和hlyA基因的四重PCR方法,能快速、准确地对嗜水气单胞菌进行检测并区分致病性与非致病性菌株。

摘要：【目的】建立一种能扩增dna J基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持。【方法】以弧菌dna J基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dna J基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性。【结果】优化后的PCR反应体系50.0μL:2×F8 Fast Long PCR Master Mix 25.0μL,上、下游引物(20μmol/L)各2.0μL,DNA模板5.0μL,灭菌水补足至50.0μL。扩增程序:94℃预变性3 min;94℃10 s,55℃15 s,72℃15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min。该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/m L。应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dna J基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dna J基因序列相似度为98.2%~99.9%。【结论】基于dna J基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dna J基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段。

摘要：【目的】建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法,为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术。【方法】根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列,在IHHNV保守区序列设计特异性引物和TaqMan-LNA探针;对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性和灵敏度;应用TaqMan-LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测,验证方法的实用性。【结果】TaqMan-LNA探针荧光定量PCR检测IHHNV的灵敏度高,约为10个病毒粒子/反应,定量范围宽,在1.6×101～1.6×108拷贝/μL的范围内具良好的线性关系;与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和TSV的RNA均无反应,特异性好;组内变异系数为0.53%～1.75%,组间变异系数为0.81%～1.14%,重复性和重现性均较好,结果稳定可靠;临床应用结果表明,300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性,阳性率为64.3%,表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高。【结论】利用TaqMan-LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点,可用于对虾IHHNV的检测。