摘要：目的在piggy Bac(PB)转座子介导下,探索在HepG2细胞中实现多个药物代谢酶稳定共表达的策略,为建立体外药物代谢和肝毒性研究的理想细胞模型奠定基础。方法首先选择3种目前针对大片段DNA使用较广的转染方法:Lipofectamine~?LTX,Gen Jet^(TM)(Ver.Ⅱ)和Neon~?Transfection System,分别转染N端标记增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)和2A串联重组细胞色素3A4(CYP3A4)和CYP2C19的PB转座子质粒(pPB-CYP3A4-2A-2C19)至HepG2细胞,48 h后比较不同方法的转染效率和细胞毒性,确立高效低毒的HepG2细胞转染方法。然后选择该法进行转染,将设计的3组PB重组转座子:单基因转座子(PB-CYP3A4)、2A串联多基因转座子(PB-CYP3A4-2A-2C19)、多个单基因转座子混合物[PB-CYP3A4,PB-CYP2C8,PB-CYP2A6,有机阴离子转运多肽1B1的PB转座子(PB-OATP1B1)]分别转染HepG2细胞,利用嘌呤霉素和GFP进行单克隆细胞筛选:挑选具有抗性且表达GFP的细胞单克隆并进行扩大培养,采用实时荧光定量PCR、Western蛋白质印迹和高效液相色谱-串联质谱联用法分别检测各组药物代谢酶m RNA、蛋白质水平及酶活性,并进行统计分析。结果 3种转染方法比较发现,Gen Jet^(TM)法的转染效率显著高于其他2种(P<0.01),介导pEGFP-N2和pPB-CYP3A4-2A-2C19的转染效率分别高达(94.2±2.5)%和(89.3±3.3)%,且该法具有较低的细胞毒性。因此选择Gen Jet^(TM)法进行后续PB转座子转染。分别转染3组PB重组转座子发现,单个转座子PB-CYP3A4和PB-CYP3A4-2A-2C19转染后,筛选获得的抗性细胞克隆中各个药物代谢酶在m RNA、蛋白质及活性水平均显著提高,其中2A可实现CYP3A4和CYP2C19药物代谢酶协同稳定表达;而多个转座子混合共转染细胞中,仅有随机几个基因表达;且各药物代谢酶基因的表达不均衡,仅CYP3A4药物代谢酶基因在单克隆细胞中表达水平明显升高。结论 Gen Jet^(TM)法可成为PB重组转座子转染HepG2细胞的有效方法。PB转座子可介导基因稳定表达;但在实现多基因共表达时,与病毒载体法不同,理论上可行的PB多转座子共转染方法其基因表达效率下降,且各基因表达不均衡。相比之下,应用2A串联多个基因串联重组PB单转座子可实现各基因稳定表达。

摘要：目的:建立西藏小型猪CYP3A基因梯度PCR扩增方法。方法:以西藏小型猪肝脏总cDNA为模板,基于CYP3A46基因引物,对CYP3A46进行梯度PCR扩增(设计温度梯度55-65℃)。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得特异性好的最佳退火温度。结果:各退火温度均能特异的扩增出1500bp左右的目的条带。结论:本反应体系及各温度梯度均可特异性扩增西藏小型猪CYP3A46基因,为进一步克隆表达奠定了基础。

摘要：为了对小区供水的水质进行检测,设计了一种基于STM32的水质在线检测系统,通过多种传感器实时检测水温、pH值及浑浊度,采用ESP8266 WiFi模块和SX1278 LoRa模块两种方案实现远程通信,以提高系统的应用范围和稳定性,并通过PC端上位机和手机客户端APP实现对目标水质的监测和预警,为小区水质检测的管理提供了一个较好的解决方案。