摘要：查尔酮异构酶是高等植物黄酮类化合物生物合成中的关键限速酶,决定了植物体内黄酮类化合物的产生。该研究从菘蓝的不同部位中提取RNA,反转录为cDNA,并设计带有酶切位点的特异性引物,克隆得到1个菘蓝查尔酮异构酶基因,命名为IiCHI。该基因全长756 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码251个氨基酸。通过同源比对显示IiCHI与拟南芥Arabidopsis thaliana的CHI蛋白亲缘关系较近,并且具有查尔酮异构酶典型的活性位点,系统发育树分析显示IiCHI归属于Ⅰ型CHI。构建原核表达载体pET28a-IiCHI并进行诱导表达,纯化后获得IiCHI的重组蛋白。体外酶活性检测实验显示IiCHI重组蛋白可以把柚皮素查尔酮催化生成柚皮素,而不能把异甘草素催化生成甘草素。实时荧光定量PCR结果显示菘蓝中IiCHI在地上部分的表达量明显高于地下部分,其中地上部分在花中表达量最高,叶与茎次之,在地下部分的须根、根的皮部与木质部几乎不表达。该研究为进一步探讨菘蓝中查尔酮异构酶的功能及其在黄酮类化合物的生物合成研究中提供了参考。

摘要：目的:研究欧洲花楸植保素糖基化修饰的相关基因,从欧洲花楸悬浮细胞中克隆糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:基于欧洲花楸转录组数据设计特异性引物,克隆得到2条Sa UGTs基因的c DNA序列,构建HIS-MBP-pET28a-SaUGTs原核表达载体,诱导表达Sa UGTs重组蛋白。结果:克隆得到2条糖基转移酶基因Sa UGT1和Sa UGT2序列,完整开放阅读框为1 458 bp和1 431 bp,分别编码485和476个氨基酸,相对分子质量为54. 27 k Da和53. 49 k Da,理论等电点为5. 50和5. 63。生物信息学分析显示,无信号肽,含有糖基转移酶家族保守结构域(PSPG)。系统进化结果显示Sa UGT1和Sa UGT2蛋白与拟南芥UGT85家族亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测显示,欧洲花楸悬浮细胞经酵母提取物(YE)诱导后,Sa UGT1和Sa UGT2的相对表达量明显上调,分别在24 h和12 h达到最大值。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达Sa UGT1和Sa UGT2重组蛋白,并得到了纯化的重组蛋白。结论:该研究首次在欧洲花楸中克隆得到糖基转移酶基因,并成功构建了原核表达载体,为进一步研究该类基因的功能奠定了基础。