摘要：目的构建基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacB毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacB(携带p15A复制子),分析sacB毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacB基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacB(携带colE1复制子和sacB405a打靶位点)。双质粒共转化大肠埃希菌BL21(DE3),脱水四环素诱导Targetron表达并对sacB基因进行打靶。涂布含有5%蔗糖和0.1 mmol/L IPTG的选择培养基,筛选sacB基因失活的阳性菌落,利用菌落PCR进一步验证Ⅱ型内含子在靶位点的插入情况。结果sacB基因表达的大肠埃希菌不能在含有5%蔗糖的平板中生长;双质粒共转化后,脱水四环素诱导Targetron表达能够插入到sacB405a靶位点;sacB基因失活后,大肠埃希菌能够在含有5%蔗糖的平板上生长,菌落PCR验证内含子插入到DNA靶位点。结论建立了基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统,为Ⅱ型内含子功能鉴定、迁移规律分析等奠定了基础。

摘要：目的:构建基于细菌Ⅱ型内含子的Targetron基因打靶载体,并在大肠杆菌中验证其功能。方法:以构建的pSY7载体为基础、以大肠杆菌lacZ基因为例,选择lacZ-1683a和lacZ-1874s位点为靶位点,利用在线设计软件设计打靶引物,通过重叠延伸PCR方法获得特异性打靶序列,并将其克隆到pSY7载体,获得pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s打靶载体,转化大肠杆菌后利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导插入型内含子的表达,最后利用菌落PCR和蓝白斑计数法验证其功能及打靶效率。结果:成功构建了pSY7-lacZ-1683a和pSY7-lacZ-1874s两种Targetron打靶载体,通过0.5 mmol/L IPTG诱导45 min后,菌落PCR显示Ⅱ型内含子能特异性插入到lacZ-1683a、lacZ-1874s位点,蓝白斑计数显示lacZ-1683a位点的打靶效率为(14.299±1.271)%,lacZ-1874s位点的打靶效率为(9.217±1.024)%。结论:构建的Targetron打靶载体能够特异性的插入大肠杆菌染色体靶位点。

摘要：[目的]在大肠杆菌中构建基于嗜热Ⅱ型内含子的高效Thermotargetron基因打靶系统,并验证其温度敏感性及打靶效率,为嗜热Ⅱ型内含子功能分析建立快速遗传检测平台。[方法]首先,以大肠杆菌lacZ基因为靶基因,根据嗜热Ⅱ型内含子碱基识别规律设计基因打靶引物,构建IPTG诱导型Thermotargetron打靶载体。然后,利用蓝白斑筛选及菌落PCR方法检测其打靶效率,并通过优化温度、IPTG浓度及诱导时间,确定Thermotargetron在大肠杆菌中的最佳打靶条件。[结果]在大肠杆菌正常生理条件下,Thermotargetron不具有基因打靶功能,而在45℃及以上条件下可获得较好的打靶效率,且在48℃、1.0 mmol/L IPTG诱导5 h时在lacZ-369a、lacZ-60a、lacZ-515a三个位点的打靶效率分别达到98.05%±1.67%、91.76%±7.08%和69.77%±5.86%。[结论]在短暂耐高温的大肠杆菌中建立了IPTG诱导的Thermotargetron基因打靶系统,该系统在任意选择的3个靶位点的打靶效率平均为86.5%±12.1%,为嗜热Ⅱ型内含子的功能机制研究奠定了平台基础。