摘要：根据H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的NS1基因序列,设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增AIV的NS1基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32α(+)中,构建重组表达质粒pET-32α(+)-NS1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导得到NS1融合蛋白;其相对分子质量约28 000,分析显示NS1基因的原核表达载体成功构建,表达蛋白以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于NS1蛋白的功能,为建立鉴别禽流感疫苗免疫和野毒感染ELISA诊断试剂盒奠定基础。

摘要：为建立快速、灵敏且可定量检测氟苯尼考耐药基因floR的环介导等温扩增方法(LAMP),根据GenBank登录的革兰阴性菌floR基因保守序列,利用PrimerExploerV4设计特异性LAMP引物,成功建立了快速检测氟苯尼考耐药floR基因的LAMP方法。该LAMP检测方法反应温度为63℃,反应时间为60min,具有可实时监测反应、定量检测出floR基因的拷贝数,以及操作简便的特点,灵敏度高,检测限为6.24×100拷贝,是普通PCR的100倍。用建立的方法检测对氟苯尼考不同敏感性的大肠埃希菌floR基因,结果显示,对氟苯尼考敏感、中介和耐药的菌株均检测到floR基因,其拷贝数与菌株MIC相关,提示floR基因不仅存在于氟苯尼考耐药菌中。所建立的floR基因LAMP检测方法可为floR基因的监测,以及氟苯尼考耐药性产生和传播机制的研究提供新的技术手段。

摘要：本研究旨在克隆并表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的核衣壳蛋白(N)。根据IBV ZZ2004株的N基因设计1对引物,提取IBV ZZ2004株的RNA,利用RT-PCR技术扩增大小约1.23kb的片段,将其插入克隆载体pGEM-T构建pGEMT-N。将pGEM-T-N用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pGEX-6P-1,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳,结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白;Western blotting检测结果显示N蛋白可与相应的IBV ZZ2004阳性血清发生特异性反应,结果表明N蛋白有一定的生物活性。本研究为IBV诊断试剂盒及新型IBV重组亚单位疫苗研制奠定基础。

摘要：为了筛选出具有较强免疫原性的猪圆环病毒3型(Porcine circovirus virus type 3,PCV-3)核衣壳(Cap)蛋白多肽,试验应用生物信息学技术,通过Garnier-Robson和Chou-Fasman两种方法分析PCV-3-Cap蛋白的二级结构,Kyte-Doolittle方法分析亲水性,Karplus-Schulz方法分析柔性,Emini方法分析表面可能性,Jameson-Wolf方法分析抗原性,经对该蛋白生物学特性进行综合分析设计合成PCV-3-Cap蛋白多肽,与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联后作为抗原免疫小鼠,测定免疫后小鼠抗体效价以及血清中免疫球蛋白IgG、IgA和细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-4(IL-4)的含量。结果表明:PCV-3-Cap蛋白的α-螺旋位于1~29,59~72,77~83,133~142,181~189 aa等区域;β-折叠位于1~15,20~33,37~52,62~111,114~123,131~155,161~167,175~193,203~215 aa等区域;转角位于12~15,32~43,137~144,167~170,174~177 aa等区域;无规则卷曲位于10~12,53~75,113~130,156~159,169~178,202~204 aa等区域;0~46,115~145 aa区域的亲水指数较高;柔性结构主要位于9~21,122~133,152~162 aa等区域;7~30,32~45,54~62,119~148 aa这些区域暴露于蛋白质表面的可能性较大;6~46,121~151 aa区域的抗原指数较高,经综合分析筛选出2段抗原性较好的肽段,分别为30~45 aa(16K)和130~145 aa(17K);2条PCV-3-Cap蛋白多肽均在第4次免疫小鼠后抗体效价达到1∶6 400;四免后小鼠的免疫球蛋白IgG、IgA及细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-4含量与对照组相比均显著提高(P<0.05)。说明筛选出的2个PCV-3-Cap蛋白多肽具有较好的抗原性。

摘要：为建立一种快速、准确并可定量检测溶血性曼氏杆菌的环介导等温扩增(LAMP)方法,本研究针对溶血性曼氏杆菌gcp基因设计5条特异性引物,在链置换DNA聚合酶的作用下,优化反应条件,并进行特异性和敏感性试验。特异性检测结果表明,建立的LAMP扩增方法可以在65 min内完成,并具有良好的特异性,检测化脓隐秘杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、牛支原体、鼠伤寒沙门菌、溶血性巴氏杆菌等其他6种常见牛呼吸道综合征致病菌和空白对照(水)时结果均为阴性;灵敏性检测结果表明,建立的LAMP方法检测溶血性曼氏杆菌质粒标准品的最低检出浓度为0.855×10^(-4)ng/μL;在对临床样品的检测中,本研究建立的LAMP方法对溶血性曼氏杆菌的检出率为52.63%(10/19)大于PCR方法的检出率47.36%(9/19)。以上结果表明,本研究建立的基于gcp基因的溶血性曼氏杆菌LAMP检测方法为溶血性曼氏杆菌的快速检测提供了一种新的技术手段,该方法特异性强、灵敏度高、快速简便,可将该方法推广至基层和流行病调查一线,应用于该病原的快速检测。