摘要：本研究旨在分析牛支原体P 48基因的序列特性、蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株P 48基因序列(GenBank登录号:CP002188.1)设计特异性引物,运用Overlap-PCR扩增获得P 48基因全长,其目的片段连接到pMD19-T载体上并进行测序,利用生物信息学方法分析和预测其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、结构功能(信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构和三级结构)。结果显示,分离株P 48基因序列为1407 bp,与Mb PG45国际标准株的同源性为100%,聚类于一支;P 48基因编码467个氨基酸残基,组成一个无跨膜、稳定的亲水性蛋白;P48蛋白存在信号肽,有44个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高(41.76%),无规则卷曲次之(37.69%)。功能预测显示,在信号转导、胁迫应答、受体等方面该蛋白存在较高概率。本研究成功克隆了分离株P 48基因片段,其编码的蛋白是一个稳定可溶、亲水性蛋白,为分析分离株P 48基因的特性和功能提供了一定的理论基础和科学依据。

摘要：试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列(登录号:AF130119.1)设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高(61.78%),无规则卷曲次之(20.78%)。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。

摘要：为筛选马鼻肺炎(equine rhinopneumonitis,ER)基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1(登录号:KF644579.1)目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒(CMV+EGFP+polyA)为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示:经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价(107.1TCID50/0.1 mL)较原毒株(108.8TCID50/0.1 mL)下降约101.7TCID50/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。

摘要：根据GenBank中已发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物。将PCV2新疆分离株(PCV2-XJ)用PK15细胞培养数代,从细胞培养物中提取病毒总DNA,并取其作为模板,PCR扩增出病毒全基因和结构基因(ORF2)。将PCR回收产物克隆到pMD18-T载体,成功构建了重组质粒pMD18-TPCV2和pMD18-T-ORF2,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的PCV2-XJ基因组全长1 768 bp。通过序列分析结果显示,PCV2-XJ与国内外PCV1、PCV2参考毒株的核苷酸同源性分别为99.5%～99.7%和68.7%;与HuB08(FJ041151)参考株核苷酸同源性最高(99.7%)。PCV2-XJ株ORF2基因与参考株核苷酸和氨基酸同源性分别高达99.3%和98.8%。

摘要：在口蹄疫二价灭活疫苗(O型、AsiaⅠ型)常规使用法国SEPPIC公司206佐剂的基础上,设计了一种缓释作用更强的双佐剂成分疫苗。通过MTT法检测淋巴细胞增殖能力、液相阻断ELISA法检测口蹄疫抗体效价及攻毒试验测定PD50来评判该双佐剂疫苗与常规疫苗的效果差异。结果显示,双佐剂疫苗组细胞免疫水平(淋巴细胞刺激指数SI为1.235±0.060)比常规佐剂疫苗组(SI为1.115±0.035)和对照组(SI为1.010±0.045)高,与常规疫苗组相比差异显著(P<0.05),与空白对照组相比,差异极显著(P<0.01)。双佐剂疫苗组O型和AsiaⅠ型抗体与常规佐剂疫苗组相比,全剂量组抗原量较充分,两组抗体水平差距不大;1/3剂量组和1/9剂量组由于抗原量较少和强缓释作用,导致抗体水平明显较低。攻毒保护结果为双佐剂疫苗组略高于常规佐剂疫苗组,前者每头份疫苗AsiaⅠ型为9.0 PD50,O型为11.84 PD50,后者每头份疫苗AsiaⅠ型为9.0PD50,O型为9.0 PD50。由分析结果可见,双佐剂疫苗可引起较好的细胞免疫应答和缓释作用,达到好的攻毒保护效果。

摘要：为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测。结果显示:2.0×10^6/mLHigh five细胞浓度、1.5MOI病毒感染量、蛋白表达时间168h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体。研究表明纯化PCV2-rCap蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原。