摘要：根据 Gen Bank登录的猪肺炎支原体 2 32株 P97基因和 J株黏附因子基因设计了 1对引物 ,以我国猪肺炎支原体Z株 (强毒株 )基因组 DNA为模板 ,通过 PCR方法扩增了该株黏附因子基因的部分序列。经序列分析后 ,重新设计了1对带有 Eco R 和 Hind 酶切位点的引物 ,并经引物的定点突变 ,PCR扩增了 Z株黏附因子的 R1 R2 区。扩增产物经双酶切后克隆到表达载体 p ET- 32 (a) +中。该重组质粒经酶切鉴定后 ,将其具有正确阅读框架的重组质粒转化到大肠杆菌 BL2 1 (DE3)感受态细胞 ,37℃下经 IPTG诱导表达 ,得到相对分子质量约 2 90 0 0的融合蛋白 ,表达量约为 11%。

摘要：根据GenBank中奶牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)CD18序列设计引物,进行PCR扩增后纯化产物,构建A/A型、A/G型和G/G型3种标准质粒,用标准质粒建立HRM检测方法。用建立的方法对300份奶牛血液样品进行检测,将其结果与Sanger测序结果进行对比,分析和验证检测结果的准确性。结果显示,样品中A/A基因型检出294例,占总体的98%;A/G基因型检出6例,占总体的2%,且两种检测方法的结果一致。结果表明,HRM检测BLAD具有简便快速、特异和灵敏等优点,可作为BLAD携带者突变筛查的优选方法。

摘要：【目的】禽流感病毒是一种全球重要的人和动物呼吸道病病原,快速确定其不同亚型对于全球流感监测具有重要的意义。本研究意在研制一种可同时鉴定禽流感病毒所有亚型的方法。【方法】根据GenBank上已发表的禽流感病毒不同亚型(16个HA亚型和9个NA亚型)的基因序列,设计合成了25对特异性引物和1对通用引物,然后以各亚型病毒的参考株RNA作为模板,建立扩增不同亚型的多重RT-PCR方法。参考各亚型病毒靶cDNAs区域的保守序列设计了52条亚型特异的探针,进而利用扩增的各亚型病毒的靶cDNAs对其特异性进行评价。在此基础上,将设计好的探针点制到处理好的玻片上,制备了禽流感病毒分型鉴定基因芯片,结合所建立的扩增不同亚型的多重RT-PCR方法,开发了禽流感病毒亚型鉴定基因芯片试剂。利用收集自49个地区的2653份标本对其特异性和敏感性进行了初步评价。【结果】用于评价的各亚型参考毒株均出现良好的特异性杂交信号,检测的敏感度可达2.47PFU/mL或2.5ng靶DNA片段,而且与禽类常见的IBV、NDV等6种病毒均无交叉反应。【结论】证明该病毒分型基因芯片具有良好的特异性、敏感性。

摘要：根据Q热贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)插入序列IS1111序列设计1套特异性引物,建立快速检测Q热的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)实时浊度检测方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,在恒温反应条件下,对靶基因的特定区域进行扩增,建立LAMP检测方法。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒,而对结核分枝杆菌(***)、衣原体(***)、布鲁氏杆菌(***)及部分牛血液的核酸样本的特异性检测结果均为阴性,无交叉反应。本研究建立的LAMP实时浊度检测方法灵敏度高、特异性好,在Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。

摘要：根据猪链球菌16 S rDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型(1或/和2型)型特异基因序列设计了4条引物,建立了快速检测猪链球菌2型(1或/和2型)的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示,所建立的多重PCR方法特异、敏感,对组织中的猪链球菌2型(1或/和2型)的最低检出水平为30 CFU/mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测,并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证,结果显示,检出阳性符合率为100%,证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。

摘要：奶牛白细胞黏附缺陷症(bovine leukocyte adhesion deficiency,BLAD)是一种常染色体隐性、致死性、遗传性疾病,严重影响奶牛生产性能和奶牛场的经济效益。为建立快速可靠的BLAD检测方法,本试验根据GenBank中BLAD CD18序列设计引物,PCR扩增后纯化产物,构建A/A、A/G和G/G 3种基因型标准质粒。用标准质粒建立焦磷酸测序检测方法。用建立的方法检测奶牛血液样品,其结果与Sanger测序结果进行比较,分析和验证检测结果的准确性。用建立的方法对300份奶牛血液样品进行检测,结果显示样品中A/A基因型检出294例,占总体比例的98%;A/G基因型检出6例,占总体比例的2%。随机抽取30份已检测样品进行Sanger测序,结果显示与焦磷酸测序法结果一致。本试验结果表明焦磷酸测序法检测BLAD,具有特异、灵敏、快速的特点,其检测结果准确可靠,适合于试剂盒的研发及应用于BLAD的临床诊断。

摘要：根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入IS1111序列设计引物和探针,建立快速检测Q热的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能够检测出10个拷贝数的阳性质粒;标准曲线相关系数为0.995,扩增效率为103%;结核分枝杆菌(***)、衣原体(***)、布鲁氏菌(***)及牛血液的核酸样本特异性检测结果均为阴性。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR法灵敏度高、特异性好,对Q热的检测与鉴定中具有良好的应用前景。

摘要：猪链球菌病是严重危害人兽健康的一种传染病.常规的猪链球菌血清学检测方法不但费时,而且只能鉴定到血清型.荧光PCR技术是一种新型扩增待检基因的方法,采用'闭管'操作,灵敏度比常规PCR高出100倍以上,而且整个过程只需要0.5～2 h,还可避免常规PCR操作时EB染色的危害及PCR后处理可能带来的假阳性,是目前为广大科研工作者所青睐的一种病原的快速鉴定方法.本研究选择MRP设计引物进行PCR,反应结束即可根据扩增曲线判定有无目的基因,从而确定待检菌是否为猪链球菌2型致病株.本方法的建立,为疫情发生后,有针对性地采取紧急防控措施、严防疫情传入传出奠定了基础.

摘要：根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入序列IS1111序列设计引物,建立快速检测Q热的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能检测出102个拷贝数的阳性质粒。标准曲线相关系数为0.991,扩增效率为98%。对结核分支杆菌、衣原体、布鲁氏杆菌及牛血液的核酸样品的特异性检测结果均为阴性。结果表明本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法灵敏度高且特异性好,可用于临床检测。

摘要：以小反刍兽疫病毒N基因序列为靶基因，通过设计引物及TaqMan探针建立快速检测小反刍兽疫的荧光PCR方法。在线BLAST分析结果表明：所设计的引物特异性强，可区分小反刍兽疫病毒及牛瘟病毒感染；所建立的方法检测线性范围为1—1×10^6拷贝质粒DNA，灵敏度可达10拷贝质粒DNA，是常规PCR法的100倍。应用所建立的方法对32份采自西藏疫区的组织样品进行检测，说明疫情在西藏没有扩散。