摘要：对布莱凯特黑牛PDSS1基因cDNA进行克隆测序,为进一步研究PDSS1基因与布莱凯特黑牛胴体内CoQ10含量、肉质性状等的相关性提供理论基础。针对Ensembl公布的牛(参照)PDSS1基因中11个外显子,设计9对引物,对布莱凯特黑牛基因组DNA进行PCR扩增、克隆测序;利用软件Lasergene 7.0拼接出PDSS1基因cDNA,提交至GenBank并进行生物信息学分析。结果表明:布莱凯特黑牛PDSS1基因cDNA全长1 574 bp,包括一个长1 257 bp的完整开放阅读框,编码418个氨基酸。PDSS1蛋白含5个跨膜区,信号肽由26个氨基酸组成,成熟肽由392个氨基酸组成。布莱凯特黑牛与牛(参照)、海福特牛、马、猪、犬、小鼠、黑猩猩、人在编码区核酸序列同源性依次为99.9%、99.8%、89.0%、83.1%、88.6%、81.1%、80.8%、80.9%;推导氨基酸序列的同源性依次为100%、99.8%、92.0%、81.8%、91.6%、79.0%、80.4%、80.7%。本试验成功克隆了布莱凯特黑牛PDSS1基因cDNA,并提交至GenBank(登录号:KC787698)。布莱凯特黑牛与牛(参照)、海福特牛在PDSS1基因编码区的同源性极高,聚为一类;与马、犬、猪、小鼠、人、黑猩猩等物种的同源性相对低些。

摘要：COQ2基因是真核生物中对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶的编码基因,该酶是CoQ10生物合成过程的主要限速酶。试验根据已公布的普通牛COQ2基因序列和其cDNA序列,对COQ2基因的7个外显子区域进行引物设计。PCR产物克隆测序后,使用生物信息学软件对测序结果进行比对和拼接,得到布莱凯特黑牛COQ2基因cDNA序列,并对其外显子3进行了PCR-SSCP分析。结果表明:布莱凯特黑牛COQ2基因cDNA序列长1 546 bp,由7个外显子组成,氨基酸编码序列为第46 bp至1 161 bp处,编码371个氨基酸;与普通牛相比,布莱凯特黑牛PPT氨基酸第324位由天冬氨酸(N)突变为组氨酸(H)。SSCP检测发现外显子3中存在一个多态位点,在102 bp处发生A→T的碱基突变,产生了AA、AB、BB三种基因型,分析发现AB基因型频率最高,B等位基因频率(0.533)比C等位基因(0.467)高,为优势等位基因。该位点多态信息含量(PIC=0.374)为中度多态。该结果为进一步分析COQ2基因SNP位点与布莱凯特黑牛CoQ10合成情况及肉质性状的关联性奠定了基础,对布莱凯特黑牛品种培育具有重要的指导意义。

摘要：利用RNAi技术,根据牛源PRNP基因cDNA设计3段siRNA序列和1个阴性对照序列,分别将其连接到RNA干扰载体pRNAT-U6.1/Neo上构建成shRNA载体,并将shRNA载体转染牛骨髓间充质干细胞(BMSC);通过Real-time PCR和Western Blotting筛选抑制效果最佳的载体;并用800mg/L G418对转染最佳载体的细胞进行药物筛选。结果显示:成功构建了3个靶向shRNA载体和1个阴性对照shRNA载体;转染后48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光的表达;Real-time PCR和Western Blotting结果显示,3个靶向shRNA载体在不同时间段均在一定程度上下调了PRNP mRNA的表达,抑制了朊蛋白PrPC的生成,得到了1个最佳干扰载体sh3;通过药物筛选出了稳定转染的细胞单克隆。本研究获得了1个有效抑制朊蛋白基因表达的shRNA载体,并筛选出稳定转染的细胞单克隆,上述结果可为抗疯牛病体细胞核移植提供供体细胞。