摘要：手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体,如何实现手性胺类化合物的不对称合成是目前人们普遍关注的一个焦点问题。ω-转氨酶(ω-Transaminase,ω-TA)是一类能直接合成对映体手性胺的天然生物催化剂。相比于(S)-ω-TA,(R)-ω-TA的研究较少,但其需求量随着手性胺类药物的发展日趋增大。提高具有潜在应用价值的(R)-ω-TA的热稳定性,将有利于手性胺的制备。本文利用Py MOL软件和YASARA软件预测来源于土曲霉Aspergillus terreus的(R)-ω-TA中具有高温度因子(B-factor)的Loop区域,通过定点突变对Loop区域表面不稳定氨基酸逐步进行删除获得突变酶。结果表明,突变酶R131del和突变酶P132-E133del半失活温度分别为41.1℃和39.4℃,比野生酶提高了2.6℃和0.9℃;在40℃下的半衰期分别为15.0 min和10.0 min,为野生酶的2.2倍和1.5倍。此外,在400 K和10 ns的分子模拟条件下,突变酶R131del在Loop区域的均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)比野生型低,突变酶P132-E133del在Loop区域增加了4个氢键。本研究通过删除(R)-ω-转氨酶Loop区域表面不稳定氨基酸提高了该蛋白的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。

摘要：以磷酸吡哆醛为辅酶的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),能专一、不可逆地催化L-谷氨酸脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。为了提高GAD热稳定性为目标,本研究通过与嗜热古细菌Thermococcus kodakarensis中GAD氨基酸序列的比对及引入脯氨酸策略,最终在短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCC No.1306的GAD突变体中筛选得到热稳定性提高的突变酶G364P。结果显示,突变酶G364P在55℃的半衰期以及半失活温度分别比野生酶提高19.4 min和5.3℃,并且突变酶G364P的催化效率与野生酶相比没有明显变化。此外,利用分子动力学模拟来验证突变对蛋白质热稳定性的影响,突变酶G364P的均方根偏差(Rootmeansquare deviation,RMSD)以及含G364的loop区域均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)均比野生酶低,引入脯氨酸增加了364位氨基酸与相邻氨基酸的疏水相互作用。文中通过引入脯氨酸成功提高了L. brevis中GAD的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。

摘要：转氨酶(ω-transaminase,ω-TA)作为一种天然的生物催化剂,在手性胺类化合物的合成中具有较好的应用前景。但ω-TA在催化非天然底物的反应过程中存在稳定性差、活性低的缺陷,大大限制了ω-TA的应用。为改善此缺陷,针对来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的(R)-ω-TA(At TA),采用基于分子动力学模拟的计算机辅助设计与随机突变、组合突变相结合的策略进行酶的热稳定性改造,获得了热稳定性与活性同步提高的最佳突变酶At TA-E104D/A246V/R266Q(M3)。与At TA野生酶(wild-type,WT)相比,M3的半衰期t1/2(35℃)由17.8 min提升至102.7 min,提升了4.8倍,半失活温度T5010比WT(38.1℃)提高2.2℃。最佳突变酶M3对丙酮酸和1-(R)-苯乙胺的催化效率分别是野生酶的1.59倍和1.56倍。分子动力学模拟与分子对接结果表明,分子内氢键与疏水相互作用的增加所导致α-螺旋的加固稳定是酶热稳定性提升的主要原因;底物分子与结合口袋氨基酸之间氢键相互作用的增加以及底物结合口袋体积的增大是导致M3催化效率提升的主要原因。底物谱测定结果表明,相较于WT,M3对11种芳香酮类化合物的催化性能均有所提升,进一步说明M3对手性胺的合成具有更高的应用价值。

摘要：谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)是用于催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)的唯一酶,提高GAD的催化活力或热稳定性,有利于GABA的高效制备和生产。以热稳定性和活性为筛选目标,通过研究短乳杆菌GAD1407三维模拟结构的拉氏图,确定不稳定氨基酸残基位点K413,采用定点突变的方法构建该位点的突变体,并测定野生型酶和突变酶的热稳定性和活力。结果表明突变酶K413A和突变酶K413I分别在热稳定性和酶活力上获得了提高,突变酶K413A在50℃的半衰期为105 min,是野生酶的2.1倍;突变酶K413I热稳定性没有明显的提高,但其酶活力却得到了有效提高,约为野生型的1.6倍。因此,通过拉氏图提供的结构信息可为利用理性设计提高GAD活性和热稳定性提供指导。

摘要：学生创新实践能力培养是新时期中国高等教育改革和实践的重点内容,创新实践能力培养体系是地方高校培养应用型人才的重要系统要素。为了解决在大学生创新实践能力培养体系中存在的“重视知识及技能训练,忽视创新思维能力和综合素质培养”“只有部分学生受益、难以惠及所有学生”等问题,从学生创新实践能力的养成机制入手分析,对人才培养方案、课程体系、相关课程的教学内容和教学方式等方面进行系统性改革,在人才培养方案中设置了全体学生必须参加的必修课程“科研实践训练”,引入了“生命科学实验设计指导”“生物化学仪器分析及检测技术”等培养学生思维能力和实践能力的理论及实践课程,改革专业实验课程的教学方式,打造产教协同和科教融合生态,营造科研创新文化,构建了一个理论教学、实验教学、实践教学相结合,课内学习与课外学习协同,校内与校外互补的应用型创新人才培养体系,提高了学生的实践能力和创新能力,全面提升了人才培养质量。

摘要：传统仪器分析类实验课程通常采用单一仪器的验证性或观摩性实验。这种教学模式下实验内容简单且固化,缺乏对学生实验方案设计、综合分析和解决问题等高阶能力和创新思维的培养;再加之大型分析仪器数量多和教学时间的限制,实验教学效果往往不尽如人意。为了克服传统“生物化学仪器分析及检测技术”教学模式的不足,以生物工程领域常见问题分析为背景,通过建立涉及多种分析仪器且适合本科生的探索性实验项目,采用基于项目导向的教学法来开展实验教学。教学实践表明,基于项目导向的实验教学方法可以有效提升教学效果。该教学模式不仅可以促进学生对理论知识的理解,而且有助于培养学生的科学思维能力和综合实验能力。