摘要：为建立鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR诊断方法,本试验根据DAdV-3基因组序列中相对保守的Fiber-2基因,通过普通PCR扩增,构建pMD19-Fiber2重组质粒为阳性标准品,在此基础上设计合成特异性引物进行实时荧光定量PCR方法的建立,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,针对DAdV-3的Fiber-2基因建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法线性关系良好,相关系数0.9989;检测DAdV-3的灵敏度为3.6×10^(2)copies/μL,敏感性比普通PCR检测方法高100倍;该方法对鸭腺病毒1型、鸭疫里默杆菌等其他常见病原均无交叉扩增反应,批内、批间变异系数均小于5%;临床样本检测与普通PCR符合率100%。以上结果表明,所建方法特异性强、敏感性高且重复性好,适用于临床检测,该方法可为DAdV-3的临床诊断、流行病学调查以及防控提供技术支持。

摘要：为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和弓形虫(Toxoplasma gondii)的双重PCR方法,根据GenBank上已登录的PCV2和弓形虫基因的保守序列,设计了2对特异性引物,并对反应体系及条件进行了优化。首先对单一PCR检测条件进行摸索,确定其最佳检测条件和灵敏性;进而建立两种病原的双重PCR检测方法,通过对退火温度、灵敏性和特异性进行测试,最终确定该方法的反应体系及条件。结果显示:双重PCR方法对PCV2和弓形虫的最低检出限分别为78.16和29.19μg/mL;对伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)等均无扩增,特异性良好。利用该方法对来自川渝地区部分猪场的63份临床样本进行检测,并与单一PCR检测结果进行比对,两种方法的符合率为100%。以上结果说明,本试验建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性强、结果可靠、方便经济,可用于PCV2和弓形虫的实验室快速检测。

摘要：为实现对韦塞尔斯布朗病病毒(Wesselsbron virus,WSLV)的快速检测,根据WSLV NS5基因保守序列,设计特异性扩增引物和探针,建立WSLV的TaqMan荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测方法,并验证方法的敏感性、特异性及临床可行性。结果显示:所建立的两种方法的核酸检测下限分别为10、100 copies/μL,对日本脑炎病毒、西尼罗病毒和坦布苏病毒核酸均无交叉反应;分别利用建立的两种检测方法对100份入境马匹样品进行检测,未检出WSLV阳性,与南非参考实验室提供的双重荧光RT-PCR检测方法结果一致。结果说明,所建的两种方法敏感性高、特异性强,可用于临床样本检测,为韦塞尔斯布朗病的出入境检验检疫、流行病学调查及防控提供了技术支撑。